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《河南工业大学》 2010年
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固定化碱性蛋白酶制备大豆肽及其抗氧化活性研究

相朝清  
【摘要】： 为了防止食品腐败变质,人们常常在其中添加一定量的抗氧化剂。目前最广泛添加的仍然是人工合成的抗氧化剂,由于这些合成的抗氧化剂对健康存在着潜藏的危害,使得它们在食品中的应用受到一定的限制。因此开发出低毒、高效、天然的抗氧化剂已经成为了近年来研究的热点。 近年来的许多研究发现,水解蛋白质得到的肽具有很好的抗氧化活性,碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的优点已被人们广泛认识,但是,应用游离蛋白酶水解,存在不稳定、成本高等缺陷,因而在工业上应用受到了限制。将蛋白酶固定化,不仅保留了蛋白酶原有的优点,而且存在分离回收容易、稳定性好等优点。 本实验首先采用多孔壳聚糖微球吸附和戊二醛交联的方法,将碱性蛋白酶固定于壳聚糖上。在pH、加酶量、温度、戊二醛体积分数和固定化时间单因素实验的基础上,利用响应面分析法对固定化碱性蛋白酶工艺条件进行了优化,得出碱性蛋白酶固定化的最佳工艺条件为:pH9.20、加酶量7512U/g、固定化温度44.58℃、戊二醛体积分数0.20%、固定化时间8.11h。在该最佳条件下,酶的回收率达56.73%。 对固定化碱性蛋白酶与游离碱性蛋白酶的Km值、最适宜温度、最适宜pH、储藏稳定性、热稳定性方面的性质进行了研究,结果表明:与游离酶相比,固定化碱性蛋白的热稳定性、pH稳定性、储藏稳定性均有所提高。 采用固定化碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解,首先以水解度(DH)为指标进行单因素试验,在此基础上以水解度和还原力为指标进行正交工艺优化。结果表明制备抗氧化能力较强的大豆分离蛋白水解物的最佳条件为:温度60℃、pH9.2、加酶量0.20g/g底物。在此条件下进行水解试验,水解度为24.34% ,水解物还原力相当于0.14mg/ml Vc。 对大豆抗氧化肽进行超滤和抗氧化活性分析,结果表明:多肽液组分中以1000以下的小肽为主,含量达到65.7%(质量分数),这些小肽的还原力相当于0.345mg/mlVc,对超氧阴离子和羟基的抑制率分别达到82.5%和91.1%。
【关键词】：大豆抗氧化肽 固定化酶 响应面 超滤
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：TS201.2
【目录】：
  • 摘要4-5
  • ABSTRACT5-12
  • 第一章 前言12-31
  • 1.1 自由基12-14
  • 1.1.1 自由基的产生12
  • 1.1.2 自由基的双重生物学功能12-14
  • 1.1.2.1 自由基造成的氧化损伤13
  • 1.1.2.2 自由基的积极作用13-14
  • 1.2 抗氧化剂14-17
  • 1.2.1 内源性自由基清除剂14-15
  • 1.2.1.1 酶类自由基清除剂14-15
  • 1.2.1.2 非酶类自由基清除剂15
  • 1.2.2 外源性自由基清除剂15-17
  • 1.3 大豆抗氧化肽17-20
  • 1.3.1 大豆多肽的组成及理化性质17
  • 1.3.1.1 大豆多肽的组成17
  • 1.3.1.2 大豆多肽的理化性质17
  • 1.3.2 大豆抗氧化肽的研究进展17-20
  • 1.3.2.1 大豆多肽的抗氧化活性17-18
  • 1.3.2.2 大豆活性肽的研究进展18-20
  • 1.4 固定化蛋白酶20-27
  • 1.4.1 酶的固定化方法20-22
  • 1.4.1.1 吸附法20-21
  • 1.4.1.2 包埋法21
  • 1.4.1.3 共价键结合法21-22
  • 1.4.1.4 交联法22
  • 1.4.2 固定化蛋白酶载体研究进展22-27
  • 1.4.2.1 天然有机高分子材料作为固定化蛋白酶载体的研究进展22-24
  • 1.4.2.2 合成有机高分子作为固定化酶载体材料的研究进展24-25
  • 1.4.2.3 无机材料25-26
  • 1.4.2.4 其他改性载体及新型载体材料26-27
  • 1.5 研究内容和意义27-31
  • 1.5.1 研究意义27
  • 1.5.2 大豆生物活性肽的制备方法27-28
  • 1.5.3 大豆多肽的应用研究进展28-29
  • 1.5.3.1 食品方面的应用28
  • 1.5.3.2 饲料方面的应用28-29
  • 1.5.3.3 生物医药方面的应用29
  • 1.5.3.4 生物发酵方面的应用29
  • 1.5.3.5 化妆品方面的应用29
  • 1.5.4 研究内容29-31
  • 1.5.4.1 碱性蛋白酶固定化工艺条件优化29
  • 1.5.4.2 固定化碱性蛋白酶性质研究29
  • 1.5.4.3 固定化碱性蛋白酶制备大豆抗氧化肽工艺优化29-30
  • 1.5.4.4 超滤法分离大豆多肽及其抗氧化活性研究30-31
  • 第二章 碱性蛋白酶固定化工艺条件优化31-43
  • 2.1 前言31
  • 2.2 材料与设备31
  • 2.3 方法31-33
  • 2.3.1 壳聚糖载体的固定化31-32
  • 2.3.2 Alcalase2.4L 碱性蛋白酶的固定化32
  • 2.3.3 游离碱性蛋白酶和固定碱性蛋白酶活性的测定32
  • 2.3.4 单因素试验设计32
  • 2.3.5 响应面试验设计32
  • 2.3.6 数据分析32-33
  • 2.4 结果与分析33-42
  • 2.4.1 固定化碱性蛋白酶单因素分析33-36
  • 2.4.1.1 加酶量对固定化效果的影响33
  • 2.4.1.2 戊二醛体积分数对固定化效果的影响33-34
  • 2.4.1.3 温度对固定化效果的影响34-35
  • 2.4.1.4 时间对固定化效果的影响35-36
  • 2.4.1.5 pH 值对固定化效果的影响36
  • 2.4.2 固定化碱性蛋白酶的响应面分析36-42
  • 2.4.2.1 多元二次模拟方程的建立及其检验36-42
  • 2.4.2.2 模型验证试验42
  • 2.5 本章小结42-43
  • 第三章 固定化碱性蛋白酶的性质研究43-48
  • 3.1 前言43
  • 3.2 固定化碱性蛋白酶的性质研究43-48
  • 3.2.1 固定化碱性蛋白酶与游离酶的KM（米氏常数）测定43-44
  • 3.2.2 固定化碱性蛋白酶与游离酶的PH 稳定性比较44-45
  • 3.2.3 固定化碱性蛋白酶与游离酶的最适宜温度比较45-46
  • 3.2.4 固定化酶与游离酶的热稳定性比较46-47
  • 3.2.5 固定化酶与原酶的储藏稳定性比较47-48
  • 3.3 本章小结48
  • 第四章 固定化碱性蛋白酶制备大豆抗氧化肽研究48-58
  • 4.1 前言48-49
  • 4.2 材料与方法49-51
  • 4.2.1 材料与仪器49
  • 4.2.2 实验方法49-51
  • 4.2.2.1 粗蛋白含量的测定49
  • 4.2.2.2 水分的测定49
  • 4.2.2.3 固定化碱性蛋白酶的制备49-50
  • 4.2.2.4 大豆分离蛋白的预处理50
  • 4.2.2.5 还原力测定50
  • 4.2.2.6 大豆肽的制备50
  • 4.2.2.7 水解度测定50-51
  • 4.2.2.8 酶解条件单因素试验51
  • 4.3 结果与分析51-57
  • 4.3.1 维生素C 标准曲线51
  • 4.3.2 单因素实验结果与分析51-55
  • 4.3.2.1 时间对酶解效果的影响51-52
  • 4.3.2.2 加酶量对酶解效果的影响52-53
  • 4.3.2.3 pH 值对酶解效果的影响53-54
  • 4.3.2.4 温度对酶解效果的影响54-55
  • 4.3.3 正交试验结果与分析55-57
  • 4.3.3.1 正交试验因素水平表55
  • 4.3.3.2 正交实验结果55
  • 4.3.3.3 正交实验分析55-57
  • 4.4 本章小结57-58
  • 第五章 超滤法分离大豆多肽及其抗氧化活性研究58-62
  • 5.1 前言58
  • 5.2 材料与方法58-60
  • 5.2.1 材料与仪器58-59
  • 5.2.2 实验方法59-60
  • 5.2.2.1 大豆多肽的分级膜分离研究59
  • 5.2.2.2 多肽浓度测定59
  • 5.2.2.3 还原力的测定59
  • 5.2.2.4 清除超氧阴离子自由基能力的测定59-60
  • 5.2.2.5 清除羟基自由基能力的测定60
  • 5.3 结果与分析60-61
  • 5.3.1 超滤膜分级分离结果60
  • 5.3.2 抗氧化活性结果与分析60-61
  • 5.4 本章小结61-62
  • 第六章 结论与展望62-64
  • 6.1 结论62-63
  • 6.1.1 响应面法优化固定化碱性蛋白酶工艺结论62
  • 6.1.2 固定化碱性蛋白酶性质研究结论62
  • 6.1.3 固定化碱性蛋白酶制备抗氧化肽工艺结论62
  • 6.1.4 超滤法分离大豆多肽及其抗氧化活性研究结论62-63
  • 6.2 展望63-64
  • 参考文献64-73
  • 致谢73-74
  • 个人简历74

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