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水—沉积物界面细菌可培养性研究

周佳  
【摘要】:传统分离培养技术仅能得到自然界微生物总数的1%左右,绝大多数处于未培养或不可培养状态,研究微生物可培养性对提高其培养效率、开发种质资源具有重要作用。本研究以太湖界面沉积物为对象,运用16S rRNA基因克隆文库和高通量测序法,研究原始细菌群落结构、基于PMA处理的活菌群落结构,并通过分离手段研究依赖于培养的细菌群落结构,以分析其细菌可培养性特征。比较研究了沉积物基因组DNA提取方法,结果表明试剂盒法提取的DNA纯度高,蛋白酶K+SDS法提取的DNA完整性好,玻璃珠+蛋白酶K+SDS法效果次之,氯仿异戊醇法提取的DNA纯度较低。使用试剂盒法提取界面沉积物基因组DNA,PCR扩增16S rRNA基因并连接于pGEM-T Easy载体,构建克隆文库。293个阳性克隆的限制性酶切分析共鉴定出41个基因型,对基因型代表克隆的16S rRNA基因序列测定和分析表明,优势菌属是Sideroxydans、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、Denitratisoma、互营杆菌属(Syntrophobacter)和甲基杆菌属(Methylobacter)。将界面沉积物经5μg/mL叠氮溴化丙锭溶液(PMA)光照处理5 min,试剂盒法提取基因组DNA,16S rRNA基因PCR产物连接于pGEM-T Easy载体,构建克隆文库,191个阳性克隆共鉴定出22个基因型,测序和比对分析表明,优势菌属是Candidatus Nitrotoga、硫杆菌属(Thiobacillus)和Steroidobacter。基于16S rRNA V3-V4区的高通量测序进一步检测了界面沉积物原始状态和经PMA处理后的菌群组成,与16S rRNA基因克隆文库得到的菌群在门(phylum)的优势顺序上保持一致,并进一步得到门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)这五个不同分类水平上各菌群的组成和比例,16S rRNA基因克隆文库中界面沉积物原始菌群和经PMA处理后菌群的优势菌属在高通量测序结果中同样占据优势地位。通过十倍梯度稀释涂布法于R2A培养基、28℃条件下,分离获得25种细菌,16S rRNA基因测序及分析结果显示,包括芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和红球菌属(Rhodococcus)等。比较分析了界面沉积物原始细菌群落结构、基于PMA处理的细菌群落结构和依赖于培养的细菌种属组成,表明界面沉积物原始细菌菌群和样品经PMA处理后的细菌菌群,在物种组成的优势顺序上有明显差异,部分菌属表现为没有活性,而菌属Steroidobacter、Denitratisoma、硫杆菌属(Thiobacillus)、Methylotenera和Candidatus Nitrotoga仅在经PMA处理沉积物的菌群中出现,实验条件下依赖于培养法没有得到。


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