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苜蓿皂苷的制备及其生物活性的研究

陈培英  
【摘要】:苜蓿皂苷是苜蓿体内生物活性较强的次生代谢产物,饲料中添加苜蓿皂苷可以降低鸡蛋胆固醇、降低仔猪腹泻率、提高动物机体抗氧化能力。本课题通过制备苜蓿皂苷,研究苜蓿皂苷对鸡胚血管生成的作用和对鸡胚脂肪代谢的影响。采用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术相结合,建立苜蓿皂苷的分离检测方法,进一步用液-质联用技术对皂苷单体分子进行鉴定,采用体外法对苜蓿皂苷的抗氧化活性进行研究;以鸡胚绒毛尿囊膜为模型,研究苜蓿皂苷对鸡胚血管生长的影响;探讨苜蓿皂苷对鸡胚发育过程中脂肪代谢的影响。1.以甲醇为萃取剂,超声波辅助萃取苜蓿皂苷;以氯仿-甲醇-水(65:35:10,下层)做展开剂,经TLC(薄层板规格5 cm×20 cm)分离后于254 nm处观察并收集不同比移值的分离组分,获得5种皂苷化合物,比移值分别为I(0.08)、II(0.18)、III(0.49)、IV(0.63)、V(0.80);将5种皂苷化合物经高效液相色谱(HPLC)进一步分离,色谱柱为Venusil Mp C18(2)(4.6 mm×250 mm),在室温下以甲醇-水(15:85)为流动相,流速为0.15 mL/min、0.2 mL/min,以及甲醇-水(20:80)做流动相,流速为0.3 mL/min,检测波长为200 nm,共获得13种苜蓿皂苷单体。采用液-质联用技术对获得的皂苷单体进行鉴定,得到质荷比(m/z)为475的离子碎片峰,经比对该离子碎片可能为大豆皂醇A(分子量474)或类似物。苜蓿皂苷在体外有较强的抗氧化能力,当苜蓿皂苷浓度从0.09mg/mL提升至0.72 mg/mL时,羟基自由基(?OH)的清除率从17.46%提升至70.29%,超氧自由基(O2-?)的清除率从9.23%提升至46.38%,DPPH自由基的清除率从26.86%提升至76.12%。2.以鸡胚绒毛尿囊膜为模型,研究苜蓿皂苷在0.00~0.36 mg/mL浓度范围内对血管生成的影响。选择新鲜、健康种蛋150枚,自然生长组10枚不做任何处理,做阳性对照,试验组分别在绒毛尿囊膜上放置0.00 mg/mL(0剂量)、0.09 mg/mL(低剂量)、0.18 mg/mL(中剂量)、0.36 mg/mL(高剂量)的3 mm自制苜蓿皂苷药片。结果表明:中剂量组的一、二级血管数量与0剂量组相比平均分别增加了34条和42条,高剂量试验组分别增加了63条、69条血管,均达到了显著水平(P0.05)。与对照组相比,中、高剂量组的小血管数量极显著的增加,分别平均增加了26条、46条血管(P0.01);而低、中、高剂量的三个试验组中大血管的数量与0剂量组相比血管增加数量不明显(P0.05),平均分别增加了3条、3条和2条血管。说明在0.00~0.36 mg/mL范围内,苜蓿皂苷可以显著增加鸡胚绒毛尿囊膜苜蓿皂苷药片周围小血管的密度与数量,对血管的新生有促进作用,且其促血管生长作用与苜蓿皂苷的浓度呈正相关性。3.以微孔注射方式,在鸡胚发育的3个关键时间点注射苜蓿皂苷,研究不同注射时间对鸡胚发育的影响。选择新鲜、健康种蛋220枚,采用单因素实验设计,对照组正常孵化,试验组分别在入孵前、第7胚龄、第18胚龄时注射0.32 mg/mL的苜蓿皂苷溶液100?L。试验结果表明:(1)不同时间注射苜蓿皂苷对雏鸡的出生体重没有影响(P0.05),但可以提高雏鸡的出壳率。18胚龄注射组的出壳率最高,与入孵前注射组和7胚龄注射组相比提高了12.5%和10.7%。(2)7胚龄注射苜蓿皂苷对血清中血脂的降低效果最好,第7胚龄注射组的总胆固醇、甘油三酯含量与对照组相比分别降低了74.45%、46.61%,均达到了极显著水平(P0.01);低密度脂蛋白胆固醇显著下降了48.5%(P0.05)。18胚龄注射苜蓿皂苷血清中抗氧化力最高,与对照组相比,18胚龄注射组血清总抗氧化能力极显著提高了42.25%(P0.01),总超氧化物歧化酶提高了35.56%(P0.05)。而各处理组高密度脂蛋白胆固醇含量降低不明显(P0.05)。(3)与对照组相比,7胚龄注射组肌肉中总饱和脂肪酸含量为66.41%,降低了4.37%;而总不饱和脂肪酸占26.47%,增加了3.55%。7胚龄注射组腹脂中总饱和脂肪酸含量为36.33%,较空白对照组降低了1.24%;总不饱和脂肪酸含量为63.36%,较空白对照组增加了2.64%。苜蓿皂苷改善了腿肌和腹脂中的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例,第7胚龄注射组改善效果最优。


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