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《河南科技大学》 2011年
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转人抗癌基因P53鸡的研究

李振红  
【摘要】:目的:通过构建含有野生型人抗癌基因P53和报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组质粒pEGFP-N1-P53,采用脂质体介导法转染鸡X期胚盘,以期培育出转人类抗癌基因鸡。 方法:RT-PCR法从早期肺癌病人的外周血中克隆出人抗癌基因P53,通过酶切、连接、转化构建出扩增质粒pMD18-T-P53,继而构建出含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒pEGFP-N1-P53。通过脂质体介导的方法转染培养的鸡胚成纤维细胞,荧光显微镜下直接观察该报告基因的表达,以检验重组质粒pEGFP-N1-P53细胞内表达的活性。设计实验,探索最佳的封口方式,保证良好的孵化效果。通过显微注射脂质体介导的真核表达质粒pEGFP-N1-P53法转染鸡X期胚盘,封口后继续孵化,每日照蛋记录鸡胚发育状态,检测死胚及成活鸡外源基因的表达及整合情况。 结果:本研究的主要结果如下: (1)从人外周血中克隆出P53基因功能区片段,结合pEGFP-N1真核表达载体构建了重组表达质粒pEGFP-N1-P53,通过PCR扩增、酶切、测序分析、鸡胚盘成纤维细胞培养方法对重组质粒进行鉴定,结果显示:成功构建了重组表达质粒pEGFP-N1-P53。 (2)种蛋开口后采用6种不同封口方法,即蛋壳膜+封口胶、蛋壳膜+保鲜膜、蛋壳膜+石蜡、蛋壳膜+封口膜、蛋壳膜+蛋壳、蛋壳膜+蛋清,并且设立对照组,以研究不同封口方式对孵化率的影响。结果显示:6个试验组鸡胚的孵化率分别为10%、3.3%、3.3%、6.7%、13.3%、16.7%,以蛋壳膜+蛋清效果较佳,对照组的出雏率为86.7%。 采用胚盘显微注射结合蛋壳膜+蛋清封口法设计试验,试验组共包含150枚种蛋,孵化结束后得死胚121枚,累计死胚率80.6%;孵化出雏鸡29只,孵化率19.3%,所得实验鸡饲养过程中死亡21只,死亡率72.4%。 121枚死胚中,有20枚检测出了绿色荧光蛋白的表达,检出率为16.5%;21只死亡鸡的组织中,有1只检测出了绿色荧光蛋白的表达,检出率为4.7%。PCR法也检测到目的基因的存在,发现其中的8枚鸡胚为人抗癌基因P53整合阳性,整合率为5.33%(8/150)。 结论:成功克隆了野生型人抗癌基因P53并构建了真核表达载体pEGFP-N1-P53,证实采用外源基因通过脂质体的包埋,胚盘显微注射法可获得转基因鸡,胚盘显微注射法是制备转基因鸡的一条有效途径。
【学位授予单位】:河南科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R734.2;S831

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