荧光蛋白标记的t-PA EGF缺失基因在鸡体内定位表达及靶向转运

【摘要】：人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, t-PA)在临床上广泛应用于心脑血管疾病的治疗。由于t-PA溶栓作用强而又不引起全身性纤溶所导致的弥漫性出血,是目前防治血栓性疾病最为理想的药物。apo-B100是极低密度脂蛋白Y(very low density lipoprotein,VLDLy)组装和分泌所必需的载脂蛋白,也是VLDLy通过受体介导的内吞作用进入卵母细胞的配体,VLDLy以完整的脂蛋白颗粒通过卵母细胞膜上的凹陷小泡以内吞的形式进入生长中的卵泡,实现在卵黄中的沉积。为探索t-PA在鸡卵黄中定向积淀的可行性,开发具有抗心血管疾病的功能性鸡蛋,本研究将t-PA功能区基因片段与鸡VLDLy组装前体apo-B100基因进行融合,利用绿色荧光蛋白的灵敏度高、便于检测的特性,构建荧光蛋白融合基因表达载体,电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌Δcrp SL1344,静脉注射转染初产蛋鸡,对融合基因在鸡体内表达及表达产物在卵黄的沉积进行定性、定量以及活性检测,为减毒沙门氏菌介导基因转移和利用家禽作为生物反应器生产t-PA功能蛋白的研究奠定基础。 本研究应用分子生物学手段,设计一对特异性引物,从已构建的真核表达载体pCDNA3-apo-tPA上扩增目的片段apo-tPA,并定向克隆到绿色荧光载体pEGFP-N1上,构建pEGFP-N1-apo-tPA表达载体,经酶切和测序鉴定基因读码框架正确后,转染体外培养鸡胚成纤维细胞,ELISA检测融合蛋白表达水平,发色底物法检测表达产物生物学活性。将重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌Δcrp SL1344,构建重组减毒沙门氏菌Δcrp SL1344(pEGFP-N1-apo-tPA)。重组菌经翅下静脉注射转染鸡体,每次间隔2d,收集不同时间生产的鸡蛋,SDS-PAGE电泳和卵黄涂片荧光镜检方法检测融合蛋白的表达状况,ELISA法检测表达水平,平板溶圈法检测生物学活性。结果显示,克隆的apo-tPA融合基因片段长2 463bp;apo-tPA-GFP融合基因在体外培养的鸡胚成纤维细胞中能够表达并分泌到细胞外,融合蛋白在转染后48h表达水平最高,达577.6ng/106细胞/24h,表达产物活性为148.3IU/106细胞/24h;重组菌转入鸡体后,主要分布在肝脏、脾脏和十二指肠;卵黄蛋白经SDS-PAGE电泳,在约1.06×105Da处有一条带,与设计的融合蛋白分子量相同;荧光镜检发现转染后第8d卵黄中即有荧光蛋白颗粒出现,第3w表达和积累水平最高,为10.4μg/mL;平板溶圈法测得活性相当于50.2μg/mL标准t-PA,此后呈现缓慢下降的趋势。 研究证明减毒鼠伤寒沙门氏菌能够介导pEGFP-N1-apo-tPA在鸡体内表达,为减毒沙门氏菌作为活载体介导外源基因在动物体内的表达研究提供了理论和技术基础;apo-B100先导序列能够引导t-PA透过卵黄膜实现融合蛋白在卵黄中沉积,这一途径的进一步完善,有望使鸡体成为药物蛋白开发生产的重要生物资源。