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《河南科技大学》 2017年
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携带NDV HN/F基因的重组减毒鸡白痢沙门菌构建及其特性

翟崇凯  
【摘要】:新城疫作为危害全球养禽业的烈性传染病之一,被世界动物卫生组织(OIE)划定为A类传染病。随着NDV变异毒株的不断出现,非典型性新城疫不断增多,鸡只免疫带毒现象普遍存在,因而大大限制了传统疫苗的使用。而DNA疫苗为新型新城疫疫苗的研制提供了新的思路,融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因作为新城疫病毒的主要保护性抗原基因,成为新城疫DNA疫苗的研究热点。目前鸡白痢沙门菌仍是危害我国养鸡业的主要致病菌之一,传统的药物治疗极易造成细菌耐药性的产生。沙门菌经基因工程减毒后,毒力显著降低,但仍具有良好的侵袭力和免疫原性,可为该病的防控提供一定的思路。减毒沙门菌可通过自然感染途径将真核质粒DNA携带进入宿主细胞内进行表达,从而能够有效地刺激机体产生黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答,作为疫苗活载体具有广阔的应用前景。因此,本研究构建了减毒鸡白痢沙门菌平衡致死真核递呈系统及携带NDV HN/F基因的重组减毒鸡白痢沙门菌株,进一步研究了其生物学及免疫学特性。1.重组减毒鸡白痢沙门菌平衡致死真核表达系统的构建及其特性本试验以质粒pcDNA3.1-Zeo(+)为骨架,将氨苄抗性基因Amp替换为SD-asd基因,成功构建无抗性基因的真核互补质粒pcD-asd;然后将质粒pc D-asd电转入减毒沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,成功构建平衡致死真核递呈系统ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd);进一步将egfp报告基因克隆入真核互补质粒pc D-asd的CMV启动子下游,成功构建重组菌株ΔcrpΔasd C79-13(pcD-asd-egfp),研究该递呈系统的生物学特性及其递呈外源抗原的能力。生物学特性鉴定结果表明,重组菌株血清型与亲本株ΔcrpΔasd C79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性与亲本株基本相似,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度较为缓慢,具有较好的体外稳定性;重组菌株的毒力较野生株C79-13降低了约104倍;重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-egfp)感染CEF细胞后,Western Blot结果表明成功表达了约为27 kDa的EGFP蛋白。上述结果表明,成功构建了重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死真核递呈系统。2.携带NDV HN/F基因的重组减毒鸡白痢沙门菌构建及其生物学特性研究本试验将RT-PCR扩增出的HN/F基因片段插入至无抗性真核互补质粒pcDasd的CMV启动子下游,分别成功构建了重组质粒pc D-asd-HN和pc D-asd-F(即pcD-asd-HN/F),然后将重组质粒电转化入?crp?asd C79-13中,成功构建了重组菌株Δcrp?asd C79-13(pc D-asd-HN/F),并进一步研究其生物学特性及其递呈HN/F蛋白的能力。试验结果表明,该重组菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)的生化特性及生长特性与?crp?asd C79-13基本保持一致;重组菌株能够在体内体外稳定携带HN/F基因;重组菌株的毒力较野生株C79-13降低了约104倍;重组菌株Δcrp?asd C79-13(pcD-asd-HN/F)感染CEF细胞后,可分别表达约为63和60 KDa的HN和F蛋白。上述结果表明,成功构建了重组NDV HN/F基因减毒鸡白痢沙门菌,且能有效递呈NDV HN/F在CEF细胞中的表达。3.携带NDV HN/F基因的重组减毒鸡白痢沙门菌免疫学试特性研究雏鸡口服免疫重组菌株,研究其免疫学特性。结果表明,重组菌株Δcrp?asd C79-13(pcD-asd-HN/F)能够显著刺激鸡体免疫器官的生长和发育(P0.05),但对鸡只体重的影响无显著性差异(P0.05);NDV抗体水平在免疫后不断增高,3 w达到峰值,显著高于对照组(P0.05),重组菌株HN组的抗体水平较重组菌株F组高,但组间没有差异;沙门菌IgG抗体水平在免疫后不断增高,3 w达到峰值,显著高于对照组(P0.05);鸡消化道sIgA抗体水平在免疫后不断增高,3 w达到峰值,显著高于对照组(P0.05),重组菌株HN组的抗体水平较重组菌株F组高,但组间没有差异;淋巴细胞的增殖水平在免疫后缓慢增高,3 w达到峰值,显著高于对照组(P0.05);IFN-γ水平在免疫后不断增高,4w达到峰值,显著高于对照组(P0.05);重组菌株Δcrp?asd C79-13(pcD-asd-HN/F)对沙门菌强毒株C79-13的攻毒保护率为100%,对NDV强毒株F48E8的攻毒保护率分别为70%和65%。上述结果表明,重组菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asdHN/F)口服免疫雏鸡后能够有效刺激机体产生体液、细胞和黏膜免疫应答反应,并具有良好的免疫保护率。
【学位授予单位】:河南科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

【参考文献】
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