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《河南科技大学》 2017年
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表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白重组减毒沙门菌的构建及其特性研究

刘莎莎  
【摘要】:鸡新城疫(Newcastle disease,ND)作为OIE A类疾病,鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)作为B类传染病,给全球养禽业造成巨大的经济损失。在我国,鸡新城疫与传染性法氏囊病一直是严重危害养禽业发展的重要传染病。鸡新城疫传染性强、死亡率高,且感染宿主范围越来越广。鸡传染性法氏囊病主要破坏鸡的体液免疫中枢器官—法氏囊,导致淋巴细胞功能受损,引起鸡体的免疫抑制,从而影响新城疫、禽流感等疫苗的免疫效果。当前由于NDV及IBDV变异株、超强毒株和新毒株的流行,导致传统疫苗免疫效果有所降低,因此,研发防控ND和IBD的新型疫苗显得尤为重要。减毒沙门菌作为疫苗活载体是一种天然的黏膜免疫增强剂,可以实现多种抗原的递呈,经口服免疫可诱导机体产生特异性的的黏膜、体液和细胞免疫应答。因此,本研究采用asd+宿主-载体平衡致死系统,将NDV HN和IBDV VP2基因串联克隆至无抗性表达载体pYA3493中,并电转化至减毒鼠伤寒沙门菌,成功构建了表达HN和VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌候选疫苗,对其生物学及免疫学特性进行研究,为新城疫-传染性法氏囊-鼠伤寒沙门菌的三联口服疫苗奠定基础。1.NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的原核表达及鉴定以携带NDV HN基因及IBDV VP2基因的的pMD18-T-HN、pMD18-T-VP2为模板,利用PCR技术扩增HN基因及VP2基因的主要抗原表位区,并通过重叠延伸PCR将HN和VP2基因片段拼接成融合片段,并克隆至pMD19-T,构建重组质粒pMD19-T-HN-VP2,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,将融合基因片段HN-VP2连接至表达载体pET32a,转化至大肠杆菌Rosetta菌株中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白HN-VP2在Rosetta菌株中成功表达,大小为104 kDa,并能够被his单抗识别,具有良好的免疫反应性。2.表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组沙门菌的构建及生物学特性分析将NDV HN和IBDV VP2融合基因定向插入至无抗性原核表达载体pYA3493中,并将重组质粒pYA-HN-VP2电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344Δcrp?cya?asd中,获得减毒重组菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2),并分析其生物学特性。Western blot结果显示减毒重组菌可稳定分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84kDa,且该融合蛋白分别能与HN抗体、VP2抗体发生反应,具有较好的免疫反应性。生物学特性结果显示重组菌株利用碳源的能力降低,生长速度减慢,毒力较SL1344至少下降105,并具有良好的侵袭性,且重组质粒pYA-HN-VP2在减毒沙门菌中可稳定遗传。3.减毒重组菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)的免疫学特性研究为测定重组菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)口服免疫后诱导雏鸡产生的免疫应答水平。本研究将重组菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)口服免疫雏鸡,免疫2次,每次间隔7d,并设SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN)、SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-VP2)、空载体、PBS及新城疫Ⅳ系与传染性法氏囊疫苗对照组。并于免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d测定各组雏鸡生长发育、NDV抗体、VP2抗体、肠黏膜sIgA和淋巴细胞分化水平,以及评价重组菌的保护率。结果显示,与对照组相比,重组菌可显著刺激鸡体免疫器官的生长发育,但对雏鸡体重的影响无显著差异(P0.05);免疫后第7d,雏鸡开始产生NDV HI抗体和VP2抗体,并于免疫后28d时达到最高,与对照组相比具有极显著差异(P0.01);肠道黏膜sIgA抗体检测结果显示,重组菌能够诱导雏鸡产生较高水平的sIgA抗体,抗体水平于免疫后28d达到高峰;淋巴细胞增殖试验结果表明重组菌能够刺激外周血淋巴细胞的分化增殖;2免之后重组菌诱导淋巴细胞产生的特异性IFN-γ的含量显著高于IL-4的含量,说明重组菌诱导的免疫应答倾向于Th1型应答;攻毒保护试验显示重组菌株对NDV、IBDV及S.typhimurium强毒的保护率分别为66.67%、77.33%和100%。以上研究显示,重组菌口服免疫后可诱导雏鸡产生黏膜、体液及细胞免疫应答,并具有良好的免疫保护率,既为ND和IBD疫苗研发提供新思路,又为防控ND和IBD奠定重要基础。
【学位授予单位】:河南科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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