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《河南农业大学》 2012年
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禽流感病毒H9N2亚型HF株的分离鉴定及生物学特性研究

张坦  
【摘要】:禽流感在全世界很多国家和地区都有发生和报道,其防控已是全世界共同关注的焦点问题。在我国,禽流感也给我国的家禽养殖业带来很多的经济损失,禽流感病毒在我国的很多省份和地区都有分离鉴定的报道。 自2010年春季以来,在安徽等省份的养鸡场发生免疫鸡群爆发疑似禽流感H9亚型的病例,临床症状主要表现为呼吸道症状,解剖表现为呼吸道黏膜出血、支气管内充满干酪样物质和肾脏肿大等。本研究为了查明致病原因,分离鉴定出致病原,并对其生物学特性进行初步研究,同时研究了该毒株在MDCK细胞上的增殖规律,为禽流感病毒的变异研究,禽流感病毒H9亚型新疫苗的开发和禽流感疫情防控,以及禽流感病毒H9亚型与MDCK细胞的适应性提供一定的参考。 采用鸡胚接种和分子生物学方法对安徽某草鸡养殖场的疑似禽流感病毒H9亚型的病例进行了致病原的分离鉴定及病原生物学特性的初步研究。 根据已经发表的禽流感病毒H_9N_2亚型全基因序列,设计8对引物,进行禽流感病毒H_9N_2亚型全基因序列的克隆测序,并对HA和NA基因序列进行同源性分析和遗传进化分析。取发病鸡的脾脏、肺脏和气管等进行研磨,冻融3次,0.22m滤器过滤,接种11日龄SPF鸡胚,盲传3代分离病毒,测定HA效价,利用阳性血清中和和有限稀释方法进行纯化。 经过HA和NA基因在NCBI上进行BLAST分析,结果表明为禽流感病毒H_9N_2亚型,并命名为A/Chicken/Anhui/HF/2010(H_9N_2),简称HF株。 将灭活的禽流感病毒H_9N_2亚型HF株的尿囊液乳化制成灭活疫苗接种SPF鸡,每周测禽流感H_9N_2亚型抗体水平。在接种HF株的灭活疫苗后,SPF鸡能够很快产生抗体,且在接种2周后抗体效价加达到6.0log2,在接种后第3周后AIV的抗体效价即可达到8.0(Log2)以上,HI抗体效价基本呈线性增长;在接种后第7周抗体效价即可接近最高值9.0(Log2);接种后第4周~7周HI效价处于8.0(Log2)到9.0(Log2)之间,直至第14周仍维持在6.0(Log2)以上。说明禽流感病毒H_9N_2亚型HF株能够刺激机体产生很好的抗体,且抗体能够维持较长时间。 将禽流感病毒H_9N_2亚型HL株和HF株共同免疫SPF鸡,在免疫28天后进行交叉攻毒试验。HF株能够完全保护HL毒株的攻毒,并且棉拭子没有分离出禽流感H_9N_2亚型病毒;HL株疫苗也能够保护鸡群不出现特异性的临床症状,但是棉拭子能够分离出禽流感病毒H_9N_2亚型病毒,说明禽流感病毒H_9N_2亚型HF株比HL株的保护免疫原性好。 对禽流感病毒H_9N_2亚型HF株与MDCK细胞的相互适应性进行了初步研究,发现禽流感病毒H_9N_2亚型HF株与MDCK细胞在1ug/ml的TPCK-胰酶浓度和MOI为0.01时能产生较高的HA效价,有利于病毒在MDCK细胞上增殖。 本论文对禽流感病毒H_9N_2的流行与防控和禽流感病毒H_9N_2与MDCK细胞的相互适应提供一定的参考依据。
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.65

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