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《河南农业大学》 2014年
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猪细小病毒HB株NS1、VP2基因的生物信息学分析以及VP2基因的原核表达

刘中原  
【摘要】:猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,同时能够引起断奶仔猪的多系统衰竭综合症。PPV感染怀孕母猪特别是初产母猪之后,主要表现为胎儿和胚胎死亡,产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪,还能引起仔猪非化脓性心肌炎、皮炎症状和消瘦性综合征。PPV主要是通过呼吸道、消化道和胎盘传播,母猪、公猪和持续性感染的外表健康猪都可传播该病。PPV与猪伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)、猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)等混合感染而加重了其危害。各国猪群血清学调查阳性检出率都比较高,我国也先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川、浙江等地分离到了多株PPV,血清学调查阳性率为80%。由于本病的广泛流行和危害,一直是猪病研究的热点之一。目前对猪细小病毒的研究主要集中在检测方法以及疫苗上,但是该病还是时有发生。而对其氨基酸序列以及空间结构的预测的研究较少,特别是对结构蛋白VP1和非结构蛋白NS1的研究上,本试验从临床上分离得到一株PPV,主要开展了一下几方面的研究: 根据NCBI数据库中公布的PPV NS1基因序列,设计了一对引物,利用PCR技术从病料中检测到一株PPV。用双抗(青链霉素)、氯仿、滤膜等处理病料之后,接种于ST细胞盲传数代出现细胞病变。提取细胞毒的核酸,扩增之后连接到pMD18-T Vector送去测序。结果显示:PCR扩增出一条360bp左右目的条带,与预期结果相符;病毒经ST细胞盲传7代之后,细胞出现轻微的拉网、扁圆等细胞病变;测序结果发现,该病毒的核酸序列与其他PPV的核酸序列同源性介于98%-100%之间。 扩增出PPV NS1全基因序列,并对其核酸组成、酶切位点、氨基酸组成、氨基酸的理化性质、疏水性、跨膜蛋白、信号肽、二级结构和三级结构进行了预测分析。结果显示,PPV NS1基因序列全长1977bp编码658个氨基酸,基因序列里面GC碱基含量占37.28%,AT碱基含量占62.72%。所含的酶切位点里HpaⅡ和MspⅠ易受到CpG甲基化的影响,DpnⅡ、MboⅠ、AlwⅠ、Eco0109Ⅰ、PpuMⅠ容易受到其他甲基化的影响。20种氨基酸里面苏氨酸所占的比重最高为10.5%,半胱氨酸所占的比重最低为2.6%,亲水区域较疏水区域多,亲水区的能力较疏水区域能力强。该基因所编码的蛋白序列中,没有跨膜蛋白和信号肽,二级结构中α-螺旋结构占28.88%,β-折叠结构占23.25%,无规则卷曲占47.87%,三级结构从立体结构上预测显示了该蛋白更加稳定的模型。 利用PCR扩增出PPV VP2基因目的片段,经连接、转化、测序获得PPV VP2全基因序列。并分析PPV VP2基因核酸组成、酶切位点、氨基酸组成、氨基酸的理化性质、疏水性、跨膜蛋白、信号肽、二级结构和三级结构。结果显示,PPV VP2基因序列全长1740bp编码579个氨基酸,核酸序列GC碱基含量38.28%,AT碱基含量占61.72%。酶切位点里HpaⅡ、MwoⅠ、TspMⅠ、AvaⅠ、MspⅠ、BsmFⅠ、SmaⅠ、MspA1Ⅰ易受到CpG甲基化的影响,BaBⅠ易受到其他甲基化的影响。20种氨基酸里面苏氨酸所占的比重最高为11.1%,半胱氨酸所占的比重最低为0.7%,亲水区域和疏水区域区别不明显,二者交替出现,且亲水和疏水的能力相当。编码区的蛋白不存在信号肽和跨膜蛋白区,二级结构中α-螺旋结构占11.74%,β-折叠结构占22.63%,无规则卷曲占65.63%,三级结构显示该蛋白缺少稳定的结构框架。 近年来猪细小病毒的感染率呈上升趋势,且多为接种猪细小病毒疫苗之后仍有该病的发生,这种现象的发生是不是因为VP2蛋白的不稳定性造成了其免疫原性和抗原性发生了变化。为初步探究其原因,根据GenBank发表的猪细小病毒的VP2基因序列设计一对特异性引物,扩增出猪细小病毒VP2基因主要的抗原表位片段,并将其克隆到pET-28a表达载体,转化到BL21表达菌里,经IPTG诱导表达出蛋白,SDS-PAGE电泳试验验证结果,为下一步建立猪细小病毒血清学检测方法奠定基础。
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.651

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