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《河南农业大学》 2014年
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部分炭疽菌的分子鉴定及快速检测

张春迪  
【摘要】:炭疽菌属(Colletotrichum Cda.)真菌是一类全球性分布的植物病原真菌,它可引起多种作物成熟前和成熟后的炭疽病,造成严重的经济损失。而植物病原炭疽菌的分类鉴定一直比较混乱,难以准确定种,给这类病害的研究带来障碍,影响防治效果。因此炭疽菌属的准确鉴定和快速检测研究是非常必要的。本研究在传统形态分类的基础上,结合ITS、GAPDH、ACT、TUB2、CAL、CHS-1基因,建立多基因聚合系统发育树,准确鉴定炭疽菌种的分类地位,对于一些错误的炭疽菌病原种名在分子鉴定的基础上进行种名修订,发现炭疽菌属新种及一些物种新的寄主,并设计特异性引物对富贵竹病原菌进行快速检测研究。具体实验结果如下:本研究在2012年至2014年间,从我国河南、广东、广西、北京、云南、湖南、海南省部分地区,采集约1000多份标本,寄主包括36科59属59种植物。通过单孢分离和组织分离法获得74个菌株,加上本实验室及本校植保学院实验室提供的11个菌株,共计85个菌株。利用形态特征结合多基因分子序列的技术鉴定出21个种,其中新种4个,分别为酸豆树炭疽菌(Colletotrichum tamarindum Meng ZhangC.D.Zhang,sp.nov.)、富贵竹炭疽菌(Colletotrichum sanderianum Meng ZhangC.D.Zhang,sp.nov.)、玉簪炭疽菌(Colletotrichumhostum Meng ZhangC.D.Zhang,sp.nov.)、升麻炭疽菌(Colletotrichum racemosum Meng ZhangC.D.Zhang,sp.nov.);中国新记录种 2 个,分别为Colletotrichum foriniaeJ.H.Simmonds 和 Colletotrichum scovillei Damm,P.F.CannonCrous;已知种 13个。另外在富贵竹上发现并验证了1种新的炭疽病原菌:君子兰炭疽菌(C.cliviae)。本研究把供试的45株代表菌株在形态上分别划分到四个种群中,然后,在多基因聚合构建的N-J系统发育树的基础上,与邻近种在形态上做比较,准确鉴定炭疽菌种。经单基因和多基因分子序列分析,炭疽菌属采用单基因很难界定菌株的种级分类地位。例如,C.fructicola中的菌株ZM130987,在ITS、GAPDH、ACT、TUB2构建的单基因系统发育树中均不与模式菌株聚为一起,且支持率低于50%(未显示),而CAL、CHS-1能将其分开(未显示),而进行多基因聚合时可以很好的将其与近似种分开(如图1)。这些情况也出现在其它分类单元。其结果表明:只有采用多基因聚合并结合形态学等其它评价方法才可以准确鉴定炭疽菌属种。致病性测试结果:本研究对富贵竹、辣椒和芒果炭疽菌病原做了柯赫氏验证,并确定其是病原菌。富贵竹两种病原菌快速检测技术研究结果:通过基因序列比对分析,从核糖体基因ITS区筛选到C.cliviae和C.dracaehophilum.两个病原菌的特异变异位点,利用Primer5.1软件设计出这两个种的两对特异性引物,并经过特异性检测,这两对引物是ZM3-7F/ZM3-7R和710F/710R,其检测灵敏度度分别为100pg/ul、1ng/ul。利用巢氏PCR技术,C.dracaehophilum病原菌的检测灵敏度可提高1015倍,达10-6ag/ul。
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S432.44

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