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海藻糖-6-磷酸合成酶基因在原核生物中的表达及其功能研究

胡元森  
【摘要】: 本文以tps1基因的cDNA,质粒pUC18和pET-30a(+)为研究基础,运用基因克隆技术,成功构建了重组表达载体pHHSM001和pHHSM002,使tps1基因在大肠杆菌中完成了功能表达,并对重组菌的抗逆性进行了研究。 1.将重组表达载体pHHSM001转化到大肠杆菌DH5 α中,经IPTG诱导,外源基因tps1获得了表达。3个浓度的IPTG诱导结果表明,终浓度为0.7mmol/L的诱导剂量最好,表达的外源蛋白占菌体总蛋白的6.2%,其次是1mmol/L的终浓度较好,外源蛋白占菌体总蛋白的4%。以pHHSM002为表达载体,tps1基因在大肠杆菌BL21中也得到了高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的17.8%。 2.本文中用灵敏度较高的高压液相色谱(HPLC)来定性检测细胞内的海藻糖,结果表明,重组菌体内有一定的海藻糖含量,而对照菌株却没有海藻糖的产生。这说明tps1基因在大肠杆菌中不仅能表达,而且表达的蛋白具有生物活性,它的导入赋予重组菌合成海藻糖的能力。同时也暗示,海藻糖-6-磷酸合成酶是海藻糖合成途径中的关键酶,这一结论与前人的试验结果一致。 3.本文还对重组菌的抗逆性进行了研究。抗盐试验结果表明,在0.4~0.6mol/L NaCl盐浓度下,对照组BL21和BL21(pET-30a(+))存活率迅速下降,而重组菌BL21(pHHSM002)存活率下降平缓,在较大范围内表现抗性;单从各个盐浓度看,重组菌的存活率也比对照组的要高,当盐浓度达到0.9mmol/L时,对照株组全部死亡,而重组菌株仍有8.5%的存活率。 抗高温试验结果表明,重组菌也具有比对照株较好的耐高温性能,50℃的高温下热击处理1小时,重组菌有15%的存活率,而对照株却 例南农业人学2002 fm徊十论文 全部死亡。但试验也同时表明,重组菌不能抗52℃以上的高温。 抗冷冻试验结果表明,在上0℃和J℃的条件下存放24小时,重 组菌BLZI (pHHSM002不对只株BLZI、BLZ l(pE-30a+))的存活率都 较低,但在相同的温度环境。厂,重组菌的存活率比对flit.菌株均;角山3叶 倍。试验发现在液氮中保存的菌体比在上0℃的存活率要高,这表明速 冻条件下菌体受到的伤害要比缓慢冷冻的轻,同时本试验也验证了中sl 基因的表达使得机体在低温环境中也受到了一定的保护。


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