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SRAP分子标记分析西瓜杂交种种子纯度

王从彦  
【摘要】: 本试验通过3个西瓜杂交组合对64个引物对进行多态性引物对筛选,用相关序列扩增多态性(SRAP)标记对5份西瓜杂交种进行种子纯度鉴定分析,并且对SRAP鉴定方法的相关技术进行了优化。本试验研究结果如下: (1)优化了适用于西瓜DNA分析的SRAP技术体系 1)优化了适用于西瓜SRAP分析的DNA提取方法。通过对不同DNA提取方法对比,结果表明:以西瓜真叶为材料且当EDTA浓度为20 mmol·L~(-1)时,CTAB法提取效果较优。 2)优化了适合于西瓜的SRAP-PCR优化反应体系和程序。本试验以西瓜基因组DNA为模板,通过从Mg~(2+)、dNTPs、primer、DNA与Taq polymerase 5因素7水平进行梯度试验,对西瓜SRAP反应体系进行优化,建立了适合于西瓜的SRAP-PCR优化反应体系,该体系总体积为15μL:Mg~(2+)2.0 mmol·L~(-1),dNTPs 0.2 mmol·L~(-1),primer 60 ng,DNA 80 ng,Taq polymerase0.5 U。SRAP-PCR优化反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。结果表明该体系和程序可满足西瓜基因组SRAP扩增的需求。 3)优化了PCR扩增产物检测技术。梯度试验结果表明:基于节约试剂成本、节约试验时间及增强染色效果等原则,固定时间为15 min、染色液浓度为0.133%、显色液浓度为1.2%时谱带显示效果较好。胶板显色后再进行固影处理,不易发生枯缩和脱落现象,利于保存及以后的研究分析。 (2)多态性引物对筛选 首先选用3个引物对对亲本进行纯度鉴定,结果表明亲本种子纯度很高。然后利用优化后的SRAP-PCR扩增反应,用西瓜品种HR-F、HR-M、HR-H-1、DF-12-F、DF-12-M、DF-12-H、my-1-F、my-1-M及my-1-H 3个西瓜杂交组合对64个引物对进行筛选。结果表现出多态性的引物对共32个,每个引物对产生谱带37~129条,共计2 184条,平均为68.25条。其中每个引物对产生多态性谱带1~14条,共计132条,平均为4.13条。每个引物对的多态性比率在1.37~18.18%之间,平均为6.04%。 (3) SRAP标记可应用于西瓜杂交种种子纯度鉴定 本试验用优化后的SRAP-PCR扩增反应,对5份西瓜杂交种进行SRAP种子纯度鉴定。5份西瓜杂交种种子纯度分别为94.92%、98.18%、94.92%、94.92%和94.64%,与田间种植鉴定结果相似率分别为95.87%、99.17%、97.85%、97.85%和98.59%。由于SRAP纯度鉴定结果低于田间种植鉴定结果,表明SRAP标记的检杂能力优于田间种植鉴定;同时,SRAP纯度鉴定结果与田间种植鉴定结果有较好的相似率和相关性,所以,可用SRAP标记鉴定替代田间种植鉴定。从而克服田间种植鉴定周期长、易受环境条件影响等缺点。


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