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《河南农业大学》 2008年
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重组人β-防御素-3基因在小鼠乳腺中表达的初步研究

徐雪丽  
【摘要】: 防御素是近年来发现的一种内源性多肽,在肌体免疫中发挥着重要作用,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、甚至是病毒都具有很强的抑杀作用,并且分子量小、热稳定好、水溶性强、无免疫原性,具有独特的研究和开发价值。 人β-防御素-3(hBD3)是2001年发现的第三种人源性β防御素,与其他防御素相比,在抗菌活性方面具有明显的优势,对革兰氏阳性菌和阴性菌具有强烈的杀灭作用,是所有抗菌肽中抗菌能力最强少数几种之一,只要几微克/毫升就可杀灭葡萄球菌、大肠杆菌、芽胞杆菌等,有很强的应用价值。我们曾使其在大肠杆菌中得到了高效表达,但是需要复性才能有活性,与传统的原核表达系统相比,应用动物乳腺生产重组蛋白产品具有生产成本低、产量大,表达产物的生物活性高、产品易于纯化等优点。本研究通过PCR克隆了牛β-酪蛋白(β-CN)基因5′调控区和hBD3的基因组序列,并构建了hBD3的真核表达载体pcDNA3.1(+)-hBD3,将此重组质粒注射到泌乳期小鼠乳腺内,进行初步的表达和活性检测。在此基础上,进一步构建牛β-CN基因5′调控区和hBD3的重组克隆载体,以实现在小鼠乳腺中的特异表达。具体试验结果如下: 1.hBD3基因的克隆根据GenBank中NT077531序列设计了一对引物,运用PCR技术,以人基因组DNA为模板,扩增了约1392bp的基因片段并把它克隆到pMD18-T载体上,构建的重组质粒pMD18-hBD3经PCR、酶切及序列测定表明,插入的序列与NT077531公布的hBD3基因同源性达到99.93%。 2.牛β-CN基因5′调控区的克隆根据GenBank中X14711序列设计一对引物,运用PCR技术,以奶牛基因组DNA为模板,扩增了约2334bp的奶牛β-酪蛋白5′调控区。测序结果表明所得序列与X14711的同源性达98.29%。奶牛β-酪蛋白基因5′调控区的克隆为进一步构建乳腺特异表达载体奠定了基础。 3.hBD3基因在小鼠乳腺中的表达将pMD18-hBD3用KpnI和XbaI双酶切,回收小片段,定向克隆至经同样酶切处理的质粒pcDNA3.1(+),构建表达载体pcDNA3.1(+)-hBD3,经PCR和双酶切鉴定,结果表明,hBD3基因已正确插入到真核表达pcDNA3.1(+)中,分别把纯化后的空载质粒pcDNA3.1和表达质粒pcDNA3.1(+)-hBD3按25μg/次/乳头的剂量直接注射到泌乳期小鼠乳腺体内,然后取其乳汁,用琼脂糖平板溶圈法检测hBD3的活性,结果表明,试验组和对照组无明显差异。
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

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【参考文献】
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