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《河南农业大学》 2008年
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烟草中依赖于NAD~+的山梨醇脱氢酶基因的克隆及功能的初步研究

靳静晨  
【摘要】: 在蔷薇科植物中,山梨醇(sorbitol)与其它植物中蔗糖的作用一样,是主要的光合作用产物和同化运输物质。国内外的研究表明,山梨醇能够在转基因植物体内积累并且可以提高植物抗环境胁迫的能力。但也有许多研究发现转基因植物中山梨醇积累过多会抑制植物的生长,甚至使它们发生病变。山梨醇脱氢酶(Sorbitol dehydrogenase, SDH)是山梨醇代谢的关键酶,催化山梨醇转化成果糖的不可逆反应,在调节库容和细胞代谢中具有重要作用。目前山梨醇脱氢酶在蔷薇科果树等木本植物上研究较多,而在其它植物中研究较少,本研究通过对烟草中NAD+依赖的山梨醇脱氢酶基因(命名为:NAD-SDH)的克隆与转基因表达分析,以期为提高农作物的抗逆性研究奠定理论基础。本研究的主要结果如下: 1.以珊西烟(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi NN)为材料,通过RT-PCR首次克隆了烟草中山梨醇脱氢酶基因(NAD-SDH),该基因全长1119bp,编码372个氨基酸残基,其氨基酸序列与番茄和葡萄的山梨醇脱氢酶同源性分别为92%和87%。 2.构建了原核表达载体pMAL-C2X+NAD-SDH,初步研究分析了烟草中NAD-SDH基因在大肠杆菌中的表达,为进一步蛋白纯化和体外生化实验打下了基础。 3.将NAD-SDH cDNA克隆至pSAT6-RFP-N1改造后的瞬时表达载体E3025-GFP中,通过基因枪轰击洋葱表皮细胞对烟草的NAD-SDH进行了亚细胞定位,结果发现细胞膜上有明显绿色荧光,因此推测NAD-SDH基因编码的蛋白存在于细胞膜上。 4.筛选出了NAD-SDH基因的T-DNA敲除突变纯合体拟南芥,并进行了抗旱的初步比较实验,发现T-DNA敲除突变纯合体拟南芥与野生型拟南芥相比,其抗旱性有一定程度的提高。此外,构建了pCAMBIA1302+NAD-SDH和pCAMBIA1305.1+ NAD-SDH植物过表达载体,采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法,把构建好的植物表达载体转入野生型拟南芥,并分别获得了转基因植株。在转pCAMBIA1302+NAD-SDH重组子的转基因植株与野生型拟南芥进行的抗旱初步比较实验中发现,过表达转基因植株的抗旱性要弱于野生型拟南芥。 综上所述,本研究克隆了烟草NAD-SDH基因的全长cDNA序列,发现烟草山梨醇脱氢酶主要分布于细胞膜上,是山梨醇代谢的主要酶,为进一步解析烟草中山梨醇脱氢酶的分子机制以及研究山梨醇在植物体内的功能提供了实验依据和理论基础。
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S572

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【引证文献】
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【同被引文献】
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