收藏本站
《河南中医药大学》 2016年
加入收藏

冬凌草二萜类物质合成途径中相关功能基因分析

尹磊  
【摘要】:目的:1.选取合适的冬凌草材料进行转录组技术分析;2根据冬凌草转录组数据分析并选择冬凌草甲素、冬凌草乙素合成途径中DXR、IDI、ISPF. ISPH基因,进行大肠杆菌克隆、测序分析,获得正确的基因序列信息;3.针对克隆测序的基因,分析其生物信息;4.分别对冬凌草无菌苗做不同部位的基因相对表达量分析;5.做原核表达分析,验证克隆测序后基因的翻译蛋白分子量大小,并为后期蛋白功能分析奠定基础。方法:1.首先将含冬凌草甲素、冬凌草乙素较低产地的冬凌草无菌苗进行炼苗,使之能在室温环境下进行生长,然后分别在冬凌草叶片表面喷施不同浓度的茉莉酸甲酯,测量喷施后0h、6h、12h、24h、48 h、72h后的冬凌草甲素含量,进而确认含量变化最高点的材料。2.获得冬凌草转录组数据后,根据冬凌草二萜类物质合成代谢路径,分别选择5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-deoxy -D- lxyluloses-pho sphatereduet oi someras e,DXR)、异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI).2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(2-C-methyl -D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase ISPF)、二 甲 基烯 丙 基焦 磷 酸合 成 酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reducta se ISPH)并分别设计克隆引物,做大肠杆菌克隆测序分析,获得正确基因序列。3.根据测序结果,在线BLAST同源性基因序列并采用在线软件进行蛋白翻译和生物信息分析。4.分别设计qRT-PCT引物,用荧光定量PCR仪做冬凌草无菌苗不同部位和添加刺激剂后胁迫诱导的表达量分析。5.针对DXR、IDI、ISPF、ISPH基因设计原核表达引物,采用PET-28 a载体、BL21感受态细胞,做原核表达分析。结果:1.添加不同浓度的刺激剂后发现在36h内冬凌草甲素含量变化不明显,因此采用本实验室前期多不同产地冬凌草的品质评价后的含冬凌草甲素、冬凌草乙素较高(DLC-G)产地的冬凌草和含冬凌草甲素、冬凌草乙素较低(DLC-D)产地的冬凌草作为冬凌草转录组测序材料。2.分别提取冬凌草DLC-G、DLC-D样品的mRNA,以mRNA为模板,研究得到cDNA文库。以cDNA文库作为转录组测序材料进行测序分析。DLC-G获得50934276 reads,GC含量为48.06%;DLC-D获得61561674 reads,GC含量为48.13%。共获得44626条unigenes。对GLC-G、GLC-D差异基因的表达分析表明,DLC-G、DLC-D2个样品共找到差异表达基因1298条,上调基因有339条,下调基因959条。3. DXR、IDI、ISPF、ISPH基因经过大肠杆菌克隆测序分析,获得了基因的序列,测序后的基因片段通过在线BLAST同源基因,最终确定下来了所选择基因(DXR、IDI、ISPF、ISPH)的基因序列信息。4.序列翻译后,发现DXR基因开放阅读匡为1422bp,编码473个氨基酸组成的蛋白质序列,蛋白分子量为51390.2,等电点为6.09;IDI基因开放阅读匡为906bp,编码301个氨基酸组成的蛋白质序列,蛋白分子量为27444.3,等电点为5.06;ISPF基因开放阅读匡为708bp,编码196个氨基酸组成的蛋白质序列,蛋白分子量为20870.1,等电点为6.75;ISPH基因开放阅读匡为1389bp,编码462个氨基酸组成的蛋白质序列,蛋白分子量为52094.0,等电点为5.82。5.不同部位基因表达量分析发现DXR基因在茎的表达量相对于根、叶较高,基本是其2倍,IDI基因在叶中的表达量较高,而在根和茎的表达量相差不大,ISPF基因在叶中的表达量最高,基本是在根中表达量的5倍,而其在茎中的表达量也基本是在根中表达量的3.8倍,ISPH基因在根、茎、叶中的表达量基本相同,三者之间差别不大;对于胁迫表达分析,茉莉酸甲酯促进DXR等4条基因的表达,只是表达量不明显,而赤霉素ATP、稀土元素镧和铈抑制其表达,其中赤霉素的抑制作用最强。6.通过IPTG诱导表达过夜后,做蛋白SDS-PAGE分析,诱导出了DXR、 ISPF、DXS基因蛋白。
【关键词】:冬凌草 转录组测序 大肠杆菌克隆测序 生物信息分析 荧光定量 原核表达
【学位授予单位】:河南中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R284
【目录】:
  • 摘要8-10
  • Abstract10-13
  • 前言13-22
  • 实验一 冬凌草转录组材料筛选22-26
  • 1 冬凌草炼苗22-23
  • 1.1 实验材料和试剂22
  • 1.2 实验方法22
  • 1.3 实验结果22-23
  • 2 冬凌草植株添加刺激剂后含量变化分析23-25
  • 2.1 实验仪器和试剂23
  • 2.2 实验方法23-24
  • 2.3 实验结果24-25
  • 3 结果讨论与分析25-26
  • 实验二 冬凌草转录组数据分析26-40
  • 1 建库测序分析26-27
  • 2 对上机测序结果进行评估27
  • 3 拼接组装后,对拼接的结果进行功能基因注释27-29
  • 4 采用以上数据库,我们对冬凌草转录组拼接、注释后的Reads分别用00、 K0G、KEGGH类分类法进行分类,结果如下29-32
  • 5 蛋白CDS预测32-33
  • 6 SSR分析33
  • 7 基因表达水平分析33-34
  • 8 基因差异表达分析34
  • 9 差异基因筛选34-35
  • 10 差异基因富集分析35-39
  • 11 讨论与分析39-40
  • 实验三 冬凌草二萜类生物合成路径相关基因的克隆测序40-47
  • 1 试验材料、菌株及试剂41-42
  • 2 实验方法42-45
  • 3 实验结果45-46
  • 4 结果讨论与分析46-47
  • 实验四 克隆基因生物信息学分析与系统树构建47-61
  • 1 实验方法47
  • 2 实验结果47-59
  • 3 结果讨论与分析59-61
  • 实验五 克隆基因的组织特异性与胁迫基因表达分析61-67
  • 1 基因组织特异性表达分析61-64
  • 2 克隆基因胁迫表达分析64-65
  • 3 讨论与分析65-67
  • 实验六 冬凌草基因原核表达分析67-75
  • 1 实验仪器与试剂67
  • 2 实验方法67-70
  • 3 实验结果70-74
  • 4 结果讨论与分析74-75
  • 讨论与总结75-77
  • 致谢77-78
  • 参考文献78-81
  • 附件181-84
  • 附件284-86
  • 附件3 综述86-91
  • 参考文献90-91

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 常永敏,刘玉清,王文祥;冬凌草片的工艺改进[J];中成药;1997年12期
2 左海军,李丹,吴斌,高慧媛,吴立军,池岛乔;冬凌草的化学成分及其抗肿瘤活性[J];沈阳药科大学学报;2005年04期
3 徐铮奎;;冬凌草有望成为“紫杉醇第二”[J];中国现代中药;2007年08期
4 薛健;宋洁;沈彩霞;;冬凌草的抗肿瘤作用研究[J];时珍国医国药;2007年09期
5 苏秀红;董诚明;冯卫生;陈随清;王龙;王伟丽;黄严;;冬凌草叶片形态多样性的研究[J];时珍国医国药;2007年10期
6 董诚明;苏秀红;李增光;程书辉;;两种冬凌草种子的生物学特性及蛋白质电泳的比较研究[J];河南科学;2008年01期
7 王绍丰;卢啟立;;冬凌草的现代研究概况[J];广州医药;2008年01期
8 苏秀红;李雪菊;董诚明;王伟丽;;冬凌草甲素、迷迭香酸在冬凌草植株内空间积累的动态规律[J];中国医药导报;2009年21期
9 廖伟玲;杜卓;张婷;郭晓蕾;温玉婷;余巧;罗爱勤;李卫民;;不同产地冬凌草定性定量质量评价[J];中南药学;2010年12期
10 董诚明;徐鹏;苏秀红;史应强;冯藜;;锌对冬凌草产量及其有效成分含量的影响[J];中国实验方剂学杂志;2011年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 董诚明;李汉伟;;营养元素对冬凌草产量及有效成分的影响[A];第八届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2009年
2 李汉伟;董诚明;;不同产地冬凌草种子蛋白电泳研究[A];第八届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2009年
3 苏秀红;史应强;徐鹏;;干旱胁迫对冬凌草幼苗内冬凌草甲素积累及其生理代谢的影响[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
4 孙汉董;韩全斌;;冬凌草的植物资源、化学和抗癌活性成分的研究[A];中国植物学会七十周年年会论文摘要汇编(1933—2003)[C];2003年
5 张瑾峰;王喆;肖义秀;丁相海;;冬凌草对食道癌细胞作用的时间生物学研究[A];2006全国时间生物医学学术会议论文集[C];2006年
6 苏秀红;董诚明;;光质对冬凌草再生植株生长及次生代谢产物的影响[A];第十届全国中药和天然药物学术研讨会论文集[C];2009年
7 宋发军;牛瑜君;;药用植物冬凌草种子脂类的分离鉴定[A];第六届全国药用植物和植物药学术研讨会论文集[C];2006年
8 董诚明;徐鹏;史应强;冯莉;;微量元素锌对冬凌草产量及冬凌草有效成分的影响[A];第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2010年
9 董诚明;王春雷;叶娟;;不同光质对冬凌草无菌苗生长及冬凌草甲素含量的影响[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
10 崔璨;陈随清;;不同产地冬凌草中迷迭香酸的含量比较[A];第十届全国中药和天然药物学术研讨会论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 卢明先;冬凌草[N];中国特产报;2003年
2 张海;神奇的冬凌草[N];中国特产报;2004年
3 王丹 孙书博;张海:“押宝”冬凌草[N];医药经济报;2004年
4 姜振东;济世药业:五根杠杆撑起冬凌草药物大产业[N];中国特产报;2007年
5 王蔚佳;医药专家把脉冬凌草产业发展方向[N];中国特产报;2007年
6 记者 孔德杰;河南要努力打造冬凌草产业的“龙头企业”[N];大众科技报;2007年
7 记者 史颂光 通讯员 成利军;济源:5300万巨资开发冬凌草[N];河南日报;2006年
8 本报记者 苑海震;河南冬凌草产业需要“龙头企业”领跑[N];河南日报;2007年
9 唐夏;冬凌草产业前景看好[N];中国消费者报;2007年
10 王蔚佳;专家把脉冬凌草产业发展方向[N];中国医药报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 孔四新;冬凌草对重金属铅的反应及其调控[D];中国农业大学;2015年
2 杜英峰;冬凌草质量控制与二萜类成分药物代谢动力学研究[D];河北医科大学;2011年
3 刘旭;冬凌草和柔茎香茶菜的化学成分及生物活性研究[D];华中科技大学;2012年
4 刘旭;冬凌草和柔茎香茶菜的化学成分及生物活性研究[D];华中科技大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曹利华;冬凌草不同类型农艺性状比较与品质分析[D];河南中医学院;2015年
2 尹磊;冬凌草二萜类物质合成途径中相关功能基因分析[D];河南中医药大学;2016年
3 王坤;冬凌草的质量及应用研究[D];辽宁中医药大学;2008年
4 崔璨;冬凌草种质资源研究[D];河南中医学院;2010年
5 伏艳艳;冬凌草提取物逆转SGC7901/ADR细胞多药耐药性及其机制研究[D];陕西师范大学;2012年
6 王大海;冬凌草化学成分及农药活性研究[D];西北农林科技大学;2010年
7 刘瑞媛;冬凌草提取物逆转肿瘤多药耐药性的研究[D];陕西师范大学;2011年
8 马征;冬凌草免疫调节作用研究及安全性评价[D];中南大学;2010年
9 雷萌;冬凌草活性成分的提取及其相关研究[D];郑州大学;2004年
10 孙万慧;信阳冬凌草植被群落调查及栽培技术研究[D];华中农业大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026