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《新乡医学院》 2014年
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熊果酸对THP1细胞HMGB1表达和NF-κB转录活性的影响

刘小梅  
【摘要】:目的研究熊果酸(UrsolicAcid, UA)对THP1细胞HMGB1表达水平和NF-κB转录因子活性的影响。方法THP1细胞用小牛血清体积比为10%的RPMI-1640培养基培养在50m1的无菌细胞培养瓶中,内含100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素,在37℃、5% CO2和饱和湿度条件下进行培养。分别用不同浓度的UA作用细胞后进行相应的检测。(1)MTT:将生长状态良好的THP1细胞接种于96孔板中,另设空白对照组,1×104个/孔,共设5组,每组设3个复孔,重复3次。分别加入不同浓度的UA(0.1、1、5、10和20μmol/L)在培养箱中作用24h。MTT检测细胞增殖情况。(2)逆转录聚合酶链反应:将生长状态良好的THP1细胞接种于24孔培养板中,1×105个/孔,共设5组,每组设3个复孔,加入不同浓度UA处理。24h后用Trizol试剂提取细胞的总RNA并逆转录为cDNA。PCR扩增HMGB1和p65基因,判断细胞中HMGB1和p65的表达变化情况。(3)Westernblot:将生长状态良好的THP1细胞接种于6孔培养板中,2×106/孔,共设5组,每组设3个复孔,加入不同浓度UA处理。48h后提取细胞的总蛋白,用Western blot检测HMGB1和p65蛋白表达情况。(4)NF-κB荧光素酶报告基因检测:将THP1细胞接种于24孔细胞培养板中,2×105个/孔,共设5组,每组设3个复孔,按照TfxTM-50 Reagent说明书进行操作,质粒NF-κB荧光素酶报告基因瞬时转染细胞,40h后加入不同浓度的UA,48h后测定荧光素酶活性。结果(1)UA对细胞增殖的影响:与对照组相比,20μmol/L UA可明显抑制THP1细胞增殖(P0.05),其它浓度UA则无明显影响。(2)UA对细胞内HMGB1和p65的影响:① HMGB1:与对照组相比,1μmol/L的UA对HMGB1 mRNA的表达有明显促进作用(P0.05),其它浓度组与对照组相比变化不大;②p65:与对照组相比,UA1 μmol/L刺激组p65mRNA的表达明显增强(P0.05)。(3)UA对细胞内HMGB1和p65蛋白表达的影响:① HMGB1:与对照组相比,1 μmol/L UA组对HMGB1蛋白表达水平有明显增高(P0.05),其它浓度组与对照组相比变化不大;②p65:与对照组相比,UA1 μmol/L刺激组p65蛋白表达水平明显增高(P0.05);UA1μmol/L+BAY11-7082作用组p65蛋白表达比单独UA1μmol/L刺激组明显降低(P0.05)。(4)UA对细胞内NF-κB转录活性的影响:与对照组相比,UA1μmol/L刺激组NF-κB转录活性明显增高(P0.05); UAlμmol/L+BAY11-7082作用组NF-κB转录活性比单独UA1μmol/L刺激组明显降低(P0.05)。结论UA可调节THP1细胞HMGB1的表达和NF-κB转录因子的活性,且呈现出一定的双向性。
【学位授予单位】:新乡医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R392

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