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《河南大学》 2016年
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RNA结合蛋白KSRP对miR-150生成的促进作用

张渊源  
【摘要】:背景:miRNAs是一类短小的、内源性启动的RNA分子,它是一种非蛋白编码旳RNA,它对基因的转录后水平的表达调控主要通过翻译抑制或mRNA降解来实现的。在大多数情况下miRNA基因通过RNA聚合酶II催化转录成miRNA的初级转绿本(pri-miRNA)。转录后,miRNA的初级转绿本(pri-miRNA)被一个称为微加工处理器的复合体剪切,该处理器由DROSHA和DGCR8以及其他的蛋白质组成。DROSHA酶是一种RNase III,DGCR8是miRNA加工处理中一种至关重要的蛋白质。被剪切为长度为65个核苷酸的转绿本被称为前体miRNA(pre-miRNA)。核加工后,pre-miRNA被一个包含Exportin-5的复合体运送到细胞质中。一旦pre-miRNA被运送到细胞质中,Dicer就剪切掉pre-miRNA的环并生成一个大约22个核苷酸的miRNA的双链。成熟miRNA的功能链伴随着Argonaute(Ago2)蛋白一起被装载到RISC复合体中。理论上,miRNA的双链可以产生两个不同的成熟的miRNA。然而,与siRNA的双链类似,miRNA通常也只有一条链被引入RISC复合体并引导复杂体与目标mRNA结合并导致mRNA的降解或翻译抑制。显而易见,miRNAs在生命体中发挥着重要的作用,包括细胞的发育时序以及细胞的增殖,分化,凋亡和肿瘤发生。它的异常表达会导致机体功能的紊乱甚至疾病,肿瘤的生成。因而miRNAs也成为多年来生物学界研究的热门。在细胞中RNA与RNA结合蛋白相互作用形成核糖核蛋白(RNP)复合体。RNA结合蛋白可影响RNA的结构和RNA之间的相互作用,并在其生物合成,稳定性,功能,运输和细胞定位中发挥关键的作用。近期的研究发现,RBPs不仅可以与mRNA结合影响其稳定性,也可以影响miRNA的加工成熟。考虑到KSRP可以促进miRNAs的加工,而我们实验室主要研究miRNAs对红系分化的影响。通过芯片分析,寻找在红系分化中和KSRP同时上调的miRNAs分子,发现KSPR和miR-150同时上调。因此本研究从KSPR和miR-150入手。目的:研究RNA结合蛋白KSRP对miR-150加工成熟的影响。方法:通过”RBPDB”网站预测到KSRP是可以与miR-150的primary序列结合的RBPs之一。我们推测KSRP可以促进miR-150的加工。接着将过表达KSRP的质粒转染到K562细胞中,24 h后提取RNA和蛋白质,然后分别用real-time PCR和Western blot的方法确定KSRP过表达成功。之后分别针对实验组,阳性对照组和阴性对照组miRNA的primary、precusor、mature序列设计引物,用以检测primary、precusor、mature的表达差异。然后收集转染KSRP过表达质粒24 h后的细胞,提取RNA,反转录,再用实时定量PCR(real-time PCR)检测过表达KSRP后内源性miR-150的primary、precusor、mature的表达变化,并分别以let-7a和miR-23b作为阳性和阴性对照,结果发现KSRP在miR-150的加工调节中具有重要的作用。为了进一步验证KSRP对miR-150加工成熟的影响,构建一个在其3’UTR分别插入实验组,阳性对照组,阴性对照组miRNA初级转录本序列的GFP表达质粒。然后让KSRP的表达质粒与GFP的表达质粒共转入293TN细胞,在转染24h后检测GFP荧光强度的变化。接下来用western blot的方法检测GFP蛋白的变化,也验证了KSRP对miR-150加工成熟的影响。为了验证KSRP与miR-150是否通过结合发挥对miR-150的加工作用,通过RNA-IP实验验证KSRP与miR-150的结合作用。结果:与对照组相比,转入过表达KSRP质粒的细胞KSRP的mRNA和蛋白水平均出现显著性上调,表明KSRP过表达成功。然后检测过表达KSRP后内源性miRNA的primary、precusor和mature的表达变化。与对照组相比,miR-150的primary表达下调而precusor和mature的表达则上调。与对照组相比,let-7a的primary表达下调而precusor和mature的表达则上调。与对照组相比,mir-23b的primary、precusor、mature的表达量均无明显变化。这些现象共同说明了KSRP对miR-150的加工成熟有促进作用。然后又通过荧光成像进一步验证了此结果。与空白对照组相比,实验组GFP荧光强度减弱,阳性对照组GFP荧光强度也减弱,阴性对照组无明显变化。这些结果进一步说明了KSRP对miR-150生成的作用。随后又通过RNA-IP实验证实KSRP可以与miR-150相互结合。结论:1.KSRP对内源性的miR-150的加工成熟有促进作用。2.KSRP可以与miR-150相结合。3.KSRP通过与miR-150结合促进其加工成熟。
【关键词】:KSRP 加工 miR-150
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q75
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-12
  • 引言12-18
  • 1.实验材料18-22
  • 1.1.酶制品及分子量Marker18
  • 1.1.1.核酸限制性内切酶18
  • 1.1.2.其它酶制品18
  • 1.1.3.DNA分子量标准18
  • 1.1.4.蛋白分子量标准18
  • 1.2.主要生化试剂18
  • 1.3.培养基、抗生素和血清18-19
  • 1.4.实验所用试剂盒19
  • 1.5.菌株19
  • 1.6.质粒19
  • 1.7.细胞系19
  • 1.8.生物信息学分析软件19-20
  • 1.9.主要仪器及设备20
  • 1.10.PCR引物20-22
  • 2.实验方法22-34
  • 2.1.主要试剂及其配制方法22-23
  • 2.1.1.细胞培养所用试剂22
  • 2.1.2.细菌培养所用的试剂22
  • 2.1.3.琼脂糖凝胶电泳所用试剂的配制22-23
  • 2.1.4.Western Blot所用试剂的配制方法23
  • 2.2.细胞实验23-25
  • 2.2.1.细胞系的培养23-24
  • 2.2.2.细胞系的转染24-25
  • 2.3.Real-time PCR25-27
  • 2.3.1.TRIZOl法提取细胞中总RNA25
  • 2.3.2.RNA质量的检测25
  • 2.3.3.mRNA cDNA第一链的合成25-26
  • 2.3.4.miRNA的cDNA第一链的合成26-27
  • 2.3.5.mRNA的Real-time PCR27
  • 2.3.6.miRNA的Real-time PCR27
  • 2.4.重组质粒的构建27-28
  • 2.5.质粒DNA的提取28-29
  • 2.5.1.质粒DNA小量提取及定量28
  • 2.5.2.质粒DNA的大量制备及纯化28-29
  • 2.6.Western blot29-30
  • 2.6.1.蛋白的提取和定量29-30
  • 2.6.2.蛋白的SDS-PAGE电泳30
  • 2.6.3.蛋白的电转移30
  • 2.6.4.杂交30
  • 2.7.RNA-IP实验30-32
  • 2.7.1.制备抗体包被的protein A30-31
  • 2.7.2.细胞的裂解31-32
  • 2.8.统计分析32-34
  • 3.实验结果34-44
  • 3.1.荧光分析实验所用重组质粒的构建34-36
  • 3.1.1.RT-PCR扩增目的基因pri-miR-15034-35
  • 3.1.2.重组质粒的酶切鉴定35
  • 3.1.3.目的片段的测序鉴定35-36
  • 3.2.KSRP过表达质粒的构建36-37
  • 3.2.1.目的基因KSRP的PCR扩增36-37
  • 3.2.2.KSRP重组质粒的PCR鉴定37
  • 3.3.KSRP对miR-150加工成熟的促进作用37-40
  • 3.3.1.检测KSRP过表达是否成功37-38
  • 3.3.2.KSRP对内源性miRNAs的加工促进作用38-40
  • 3.4.荧光成像实验确定KSRP对miR-150的加工促进作用40-42
  • 3.5.RNA Immunoprecipitation(RNA-IP)实验验证了KSRP和miR-150的结合42-44
  • 4.讨论44-50
  • 5.实验结论50-52
  • 参考文献52-58
  • 文献综述 miRNA生物起源的调控机制58-72
  • 参考文献64-72
  • 致谢72-74
  • 攻读硕士期间发表和待发表的学术论文74-75

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