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《河南大学》 2016年
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自噬缺失激活HSF1介导的热休克反应的分子机制

韩文秀  
【摘要】:背景自噬(autophagy)是真核生物细胞内去除破损细胞器和半衰期较长蛋白质的一种生理过程,是调控细胞内稳态应激反应之一,在进化上十分保守。自噬根据发生过程的不同,可以分为三种:巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。其中最典型的是巨自噬,其主要是通过形成自噬体并与溶酶体融合成自噬溶酶体来降解细胞自身物质。自噬的发生主要由自噬相关基因(autophagy relation genes,ATGs)控制。ATG7是自噬体形成的关键调节因子,在ATG12和ATG5结合过程以及LC3的脂化过程中起重要作用,能够有效的激活自噬,防止错误折叠蛋白的累积。在正常生理条件下,自噬负责去除损坏的或无功能的细胞器和蛋白质,从而给细胞代谢提供氨基酸和其它必需成分。在应激刺激下(如营养匮乏,氧化应激,有毒化合物,以及病原体的侵入),自噬被激活去除损坏的细胞内组分。自噬对于细胞分化和组织重塑必不可少,同时对细胞的生存和死亡发挥重要作用。热休克反应是细胞中另外一种重要的保护性机制。热休克反应(heat shock response,HSR)是生物体和细胞应对各种外界压力条件,通过激活热休克转录因子(HSFs),调节热休克蛋白(HSPs)的表达,从而保持细胞内稳态的一种生理过程。已知的热休克转录因子有四种:HSF1、HSF2、HSF3和HSF4,其中HSF1是介导热休克反应的主要转录因子。在正常生理条件下,热休克蛋白的表达量很少,只占总蛋白的1-2﹪。在热激、活性氧过多或炎症的刺激下,Hsf1被激活后结合到下游热休克蛋白基因的启动子上,促进热休克蛋白的表达,从而维持细胞内环境稳态。热休克蛋白根据分子量不同,可以分成两类:一类是ATP依赖型的大分子HSPs,如HSP100、HSP90、HSP70和HSP60;一类是不依赖ATP的小分子HSPs,如HSP25和αB-crystallin等。在不同的组织或细胞中,热休克蛋白的功能具有差异性。有研究表明,HSP70、HSP25和αB-crystallin热休克蛋白具有抗凋亡的功能。HSP25在亨廷顿氏舞蹈症的发生中起重要的保护作用,HSP25的突变可能会导致运动神经元的病变。近来发现应激反应的转录因子如p53,NF-κB和STAT3在自噬中发挥重要调节作用。同样作为转录因子,HSF1被发现可以通过直接调节ATG7介导自噬来保护肿瘤细胞抵抗化疗作用。肺腺癌A549细胞系中过表达的HSP70可以调节m TOR/Akt信号通路从而抑制细胞自噬。然而,小鼠成纤维细胞和小鼠近端肾小管细胞中自噬对HSF1介导的热休克反应的调控并不清楚。据研究报道,自噬的缺失和许多疾病的发生相关,比如肌肉萎缩、神经退行性疾病、肿瘤的发生以及衰老等。热休克反应和自噬均为细胞应对外界环境压力的重要保护性机制。通过本课题的研究,我们将深入探讨HSF1介导的热休克反应是否在自噬缺失的细胞中存在代偿作用。目的本课题以敲除ATG7的小鼠成纤维细胞和小鼠近端肾小管细胞为研究对象,探究自噬缺失引发的HSF1介导的热休克反应及其分子机制。方法1.应用NIH3T3的方法建立ATG7~(F/F)转基因小鼠成纤维细胞(MEF/ATG7~(F/F))和敲除ATG7的小鼠成纤维细胞(MEF/ATG7~(-/-)),并应用免疫印记检测两种细胞中的自噬和热休克反应水平;2.在应激刺激(43℃热激和MG132处理)处理下,用Real time PCR和免疫印记测定细胞内热休克蛋白的m RNA和蛋白表达水平;3.在不处理和热休克刺激下进行免疫印记测定小鼠近端肾小管细胞MPTC/ATG7~(F/F)和MPTC/ATG7~(-/-)中的自噬和热休克反应水平;4.染色质免疫沉淀实验(ChIP)检测43℃热激刺激下两种稳定株细胞中HSF1和热休克蛋白基因启动子的结合情况;5.分别用细胞核质分离实验和HSF1的三聚化检测实验探究43℃热激刺激下HSF1转录活性激活的分子机制;6.分别用EBSS和顺铂(cis-platin)处理两种细胞,应用免疫印迹方法探究敲除ATG7后高表达的HSP25对自噬缺失细胞的作用。结果敲除小鼠成纤维细胞和小鼠近端肾小管细胞中的ATG7基因,可以阻断细胞自噬;自噬被阻断后,细胞内HSP25的蛋白及m RNA表达量均增多;HSF1三聚化增加使HSF1活性增强,从而直接促进HSP25的表达;高表达的HSP25与自噬缺失细胞的抗凋亡有关。结论敲除ATG7基因后,细胞内HSF1介导的HSP25表达被激活,从而参与自噬缺失细胞内稳态的调控。
【关键词】:自噬 ATG7 HSF1 HSP25 抗凋亡
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R329.2
【目录】:
  • 摘要4-7
  • ABSTRACT7-12
  • 缩略词表12-13
  • 引言13-15
  • 1 实验仪器与材料试剂15-21
  • 1.1 实验仪器15-16
  • 1.2 细胞株、细菌及质粒来源16
  • 1.3 实验试剂16-17
  • 1.4 主要试剂的配制17-21
  • 2 实验方法21-33
  • 2.1 感受态的制备、质粒的转化和提取21-22
  • 2.1.1 氯化钙(CaCl_2)法制备感受态21
  • 2.1.2 质粒的转化21-22
  • 2.1.3 质粒的提取22
  • 2.2 细胞培养22-24
  • 2.2.1 细胞复苏22
  • 2.2.2 细胞传代22
  • 2.2.3 细胞冻存22-23
  • 2.2.4 细胞计数23
  • 2.2.5 转染23
  • 2.2.6 稳定株的构建23-24
  • 2.3 热休克方法24
  • 2.4 蛋白质的提取及浓度测定24-25
  • 2.4.1 蛋白质提取24-25
  • 2.4.2 BCA法测蛋白浓度25
  • 2.5 Western Blot25-27
  • 2.6 RNA的提取27-28
  • 2.7 反转录28
  • 2.8 Real time PCR28-29
  • 2.9 染色质免疫共沉淀(ChIP)29-31
  • 2.10 细胞核质分离实验31-32
  • 2.11 HSF1三聚化检测实验32-33
  • 3 实验结果33-43
  • 3.1 敲除ATG7使小鼠成纤维细胞中自噬被阻断,HSP25的表达被激活33-34
  • 3.2 不同应激刺激下,敲除ATG7可以激活MEF细胞中HSP25的蛋白表达34-35
  • 3.3 热激刺激下,敲除ATG7可以提高MEF细胞中HSP25的mRNA表达水平35-36
  • 3.4 敲除小鼠近端肾小管细胞中的ATG7基因可以阻断细胞的自噬,同时激活HSP25的蛋白表达36-37
  • 3.5 热激刺激下,敲除ATG7后HSF1结合hsp25启动子的能力增强37-38
  • 3.6 热激刺激下,阻断自噬不影响HSF1的核质分布,但阻断自噬促进HSF1的三聚化38-40
  • 3.7 高表达的HSP25与自噬缺失细胞的抗凋亡有关40-43
  • 4 讨论43-47
  • 结论47-49
  • 参考文献49-53
  • 综述53-65
  • 参考文献61-65
  • 致谢65-67
  • 攻读学位期间参加的学术会议及研究成果67-68

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