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《河南大学》 2016年
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棉花PMEs基因家族进化分析与GhJAZ基因功能研究

李伟杰  
【摘要】:棉花是世界上重要的天然纤维作物之一,是纺织工业重要的原材料。目前,纺织工业对棉纤维品质的要求愈来愈高,尤其是需要纤维比强度更高的棉纤维。提高棉纤维品质变得日益重要,现在已变成棉花生物学研究领域的一个重要研究热点。棉纤维发育过程可分为四个阶段:起始分化期、伸长期、次生壁加厚期和脱水成熟期。其中次生壁加厚期与棉纤维的比强度的形成关系密切。成熟棉纤维的主要结构是细胞壁,果胶作为细胞壁的重要组成成分,其新陈代谢与纤维品质形成关系密切。本研究对棉花基因组中的果胶甲酯酶(Pectin methylesterase,PME;EC 3.1.1.11)家族基因进行鉴定和系统分析的基础上,以陆地棉(69307)和亚洲棉(石系亚1号)为实验材料,结合已有EST等转录信息,对果胶甲酯酶基因家族的部分成员进行表达分析,鉴定出了在纤维细胞中优势表达的成员,并对其在纤维细胞不同时期的表达量进行了系统分析,最后对果胶甲酯酶基因的功能进行了初步验证。比较系统的分析了棉花A、D、AD基因组中的果胶甲酯酶基因家族成员。利用棉属异源四倍体陆地棉基因组(AD组)、二倍体雷蒙德氏棉基因组(A组)和亚洲棉(D组)基因组信息,共鉴定出293个PMEs基因成员,其中AD组135个(Gh PME001-Gh PME135),A组80个(Ga PME01-Ga PME80),D组78个(Gr PME01-Gr PME78),是一类在植物进化中相对比较保守的家族。系统的分析了果胶甲酯酶基因家族的进化关系。本研究从四倍体陆地棉(G.hirsutum L.)蛋白库中鉴定出了135个PMEs基因,按聚类关系分为8个亚家族;从二倍体亚洲棉(G.arboretum L.)中鉴定了80个PMEs基因,按聚类关系分成4个亚家族;从二倍体雷蒙德氏棉(G.raimondii)中鉴定了78个PMEs基因,按聚类关系分成4个亚家族,并系统分析了其基因结构、蛋白保守结构域、蛋白理化性质、空间立体结构、基因表达和进化情况,为进一步研究棉花基因组中的PMEs基因功能奠定基础。我们做了棉花和其他从进化树分析可知,同一物种内的PMEs基因序列相似性较高,亲缘关系也相对较近;基因结构分析结果显示,大部分PMEs基因的外显子数量都为2-3个,少数PMEs基因的外显子数量差异较大,4-6个不等。对保守结构域分析可知,PMEs家族基因都具有C-末端相对保守的结构域Pectinesterase(PME),而N末端在进化过程中较不严格,部分该家族成员含有Pectin methylesterase inhibitor(PMEI)保守结构域。为进一步研究棉花中PMEs基因的功能提供了重要依据。本研究表达谱研究结果表明,亚洲棉PMEs家族第一亚家族的基因在不同纤维发育时期中的表达水平不同,其中16个基因在次生壁加厚期表达水平较高,在其他时期表达水平较低,存在组织特异性。我们通过转录组分析发现有四个基因在陆地棉和亚洲棉纤维次生壁加厚期表达量差异较大,分析他们的基因结构,保守结构域及Motif均没有差异,但他们在启动子元件方面有一定的差异。三个棉种果胶甲酯酶基因家族成员的进化压力Ka/Ks值均小于1。Ka/Ks的比值说明复制事件过后,复制的基因经历了纯化选择。Gh PME36的表性分析。克隆了棉花Gh PME36基因。构建了p BI121-Gh PME36超表达载体,采用花浸法成功转化野生型拟南芥Col-0,结果显示Gh PME36的株高,莲座叶长度,抽薹开花时间和根长与野生型表型有明显差异,果荚大小基本相同。Gh JAZ转基因拟南芥的表性分型为,根长增加,抽薹开花提前,果荚变短增粗,表皮毛出现较晚,最终表皮毛数目与WT相一致。本研究通过对棉花果胶甲酯酶PMEs的家族的鉴定和表达差异分析,以及转基因拟南芥的表型分析,为进一步研究果胶甲酯酶PMEs对棉纤维发育的影响奠定了基础。
【关键词】:果胶甲酯酶 基因家族 进化 基因表达 棉纤维发育
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S562;Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-9
  • 缩略词表9-14
  • 1 前言14-24
  • 1.1 棉纤维品质性状的研究意义15
  • 1.2 棉纤维的发育15-19
  • 1.2.1 起始期16-17
  • 1.2.2 伸长期17-18
  • 1.2.3 次生壁加厚期18
  • 1.2.4 成熟期18-19
  • 1.3 果胶甲酯酶的研究进展19-20
  • 1.3.1 果胶甲酯酶的研究意义19
  • 1.3.2 果胶19
  • 1.3.3 果胶甲酯酶19-20
  • 1.4 棉纤维次生壁加厚期的相关研究20-21
  • 1.5 本研究的目的和意义21-24
  • 2 材料与方法24-42
  • 2.1 材料24-27
  • 2.1.1 实验材料的种植24
  • 2.1.2 取材24
  • 2.1.3 菌株24-25
  • 2.1.4 载体25
  • 2.1.5 所用试剂25
  • 2.1.6 缓冲液、培养基及抗生素25-27
  • 2.2 实验仪器27-28
  • 2.3 实验方法28-42
  • 2.3.1 相关数据下载28
  • 2.3.2 棉花PMEs家族基因的识别与鉴定28
  • 2.3.3 PMEs家族进化分析28-29
  • 2.3.4 亚洲棉PMEs基因家族的基本结构预测和分析29
  • 2.3.5 亚洲棉PMEs基因家族的EST电子频率分析29
  • 2.3.6 总RNA的提取和qRT-PCR29-31
  • 2.3.7 qRT-PCR表达特性分析31-32
  • 2.3.8 PMEs粗酶液的提取与酶活性测定32-33
  • 2.3.9 GhPME36转基因拟南芥植株的获得33
  • 2.3.10 陆地棉GhJAZ基因的克隆33-42
  • 3 结果与分析42-78
  • 3.1 陆地棉69307和石系亚1号纤维品质概况42
  • 3.2 棉花总RNA提取42-43
  • 3.3 棉花PMEs基因家族的鉴定和分析43-61
  • 3.3.1 棉花全基因组水平PMEs基因家族成员鉴定43-44
  • 3.3.2 棉花PMEs基因家族的染色体定位44-49
  • 3.3.3 棉花果胶甲酯酶基因结构和蛋白结构域分析49-52
  • 3.3.4 陆地棉、亚洲棉、雷蒙德氏棉PMEs基因家族的进化关系分析52
  • 3.3.5 PMEs基因家族成员的进化分析52-55
  • 3.3.6 转录组分析55-59
  • 3.3.7 荧光定量表达分析59-60
  • 3.3.8 果胶甲酯酶活性测定60-61
  • 3.4 亚洲棉PMEs家族基因的分析61-68
  • 3.4.1 亚洲棉PME蛋白家族基本结构及理化性质分析61-65
  • 3.4.2 亚洲棉PMEs蛋白的三级结构65
  • 3.4.3 亚洲棉PMEs基因家族的EST电子频率分析65-66
  • 3.4.4 亚洲棉果胶甲酯酶第一亚家族基因的荧光定量表达分析66-68
  • 3.5 GhPME36转基因植株表型68-70
  • 3.6 GhJAZ基因基因的克隆与分析70-78
  • 3.6.1 GhJAZ基因的来源70
  • 3.6.2 GhJAZ基因的cDNA全长序列克隆70-72
  • 3.6.3 GhJAZ基因表达模式分析72
  • 3.6.4 GhJAZ基因功能的初步验证72-78
  • 4 讨论78-84
  • 4.1 棉花果胶甲酯酶基因家族与棉花全基因组78
  • 4.2 棉花果胶甲酯酶家族基因的进化78-79
  • 4.3 棉花果胶甲酯酶基因研究的重要意义79-80
  • 4.4 直系同源基因的表达差异及原因80
  • 4.5 果胶甲酯酶家族基因与棉纤维发育的关系80-81
  • 4.6 基因来源的准确性81
  • 4.7 JAZ基因与棉纤维发育81-84
  • 结论84-86
  • 参考文献86-94
  • 附录94-114
  • 硕士期间论文发表情况114-116
  • 致谢116-117

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