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《河南大学》 2016年
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PDRAD1参与调节H~+-ATPase活性与有机酸分泌介导低磷诱导的根际酸化反应

崔长艳  
【摘要】:磷是植物正常生长所必需的大量元素,土壤中的总磷储量虽然丰富,但多以难溶性磷或有机磷等形式存在,不可以直接被植物体吸收利用,所以植物经常会面临低磷的胁迫。在低磷条件下,植物可以通过根际酸化作用促进土壤中难溶性磷的溶解,提高植物根际周围有效磷的浓度,以此增加植物对土壤中磷的吸收和利用。但植物如何感知低磷信号进而调控根际酸化的分子机制至今还不清楚。课题在前期工作中,利用pH指示剂溴甲酚紫进行原位显色,依此筛选得到一株根际酸化缺失突变体pdrad1-1。在低磷条件下,该突变体的根际酸化能力弱于WT,花青素含量及侧根密度低于WT,表现出对低磷胁迫不敏感的特性。此外,该突变体叶中磷含量高于WT,且地上部分与地下部分磷含量的比值高于WT,表明其从地下部分到地上部分的磷转运能力强于WT。图位克隆结果表明,PDRAD1定位于5号染色体上端。突变体基因在编码区缺失25bp的碱基,移码突变致使蛋白质翻译提前终止。从Salk实验室获得的等位T-DNA插入突变体pdrad1-2,其在低磷胁迫下表型特征与该突变体表现基本一致。本实验利用突变体pdrad1-1,pdrad1-2以及转基因回补株系和超表达株系,进一步研究了PDRAD1基因在低磷诱导的根际酸化及磷营养利用方面的作用。利用pH原位显色法测定植株的根际酸化的实验结果显示,在低磷胁迫下,突变体pdrad1-1,pdrad1-2的根际酸化能力一致,均弱于WT;PDRAD1转基因回补株系的根际酸化能力与WT一致;而超表达株系的根际酸化能力明显强于WT。另外,转基因回补株系在低磷胁迫下表现出与WT一致的花青素积累及侧根密度增加的典型低磷胁迫特征;且从地下部分到地上部分的磷转运能力基本与WT一致,均弱于突变体。以上结果表明,PDRAD1参与调节低磷诱导的根际酸化反应和无机磷在植物体内的转运。GUS转基因植株染色结果显示,该基因在叶片和根中都有表达,且在低磷处理后染色加深;对GUS酶活测定,发现其在低磷胁迫下活性升高。以上结果说明,低磷诱导PDRAD1表达。在培养基中加入细胞质膜H~+-ATPase特异性抑制剂Na_3VO_4后,正常和低磷培养基上的根际酸化反应均受到了明显抑制;测定突变体pdrad1-1以及部分超表达株系根部细胞质膜上H~+-ATPase活性,发现在低磷胁迫下,突变体pdrad1-1质膜上的H~+-ATPase活性显著低于WT,而超表达株系质膜上的H~+-ATPase活性高于WT;此外本实验还利用液相色谱和质谱联用法,测定了植株根系分泌物中的有机酸含量,结果发现在低磷胁迫下,突变体根系分泌物中有机酸含量普遍低于WT,且以琥珀酸含量的差异最为明显。综上表明,突变基因可能通过调节质膜上H~+-ATPase的活性和根际有机酸的分泌来影响突变体的根际酸化能力。另外,对突变体及超表达株系的侧根及根毛密度观测分析,结果发现,突变体pdrad1-1的侧根及根毛密度均小于野生型WT,而超表达植株的根毛密度大于野生型WT,由以上结果推测,PDRAD1影响了植株侧根与根毛的形成和发育。本实验还对不同浓度氮源处理下的突变体进行了生理生化指标分析和磷含量测定,结果发现在缺铵条件下,突变体的磷转运能力进一步提高;此外在低磷条件下,植物组织中的铵会得到大量积累;以上结果说明该基因对营养元素氮和磷都有调控作用。另外,PDRAD1::p CAMBIA1300-GFP载体的构建,为进一步分析基因PDRAD1的亚细胞定位及其与磷的关系准备了材料。
【关键词】:PDRAD1 低磷 根际酸化
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q945
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-12
  • 缩写词12-13
  • 1 前言13-21
  • 1.1 磷与植物体之间的关系13
  • 1.2 土壤中磷元素的现状13
  • 1.3 植物体对磷的吸收利用13-14
  • 1.4 植物在低磷胁迫下的应对策略14-18
  • 1.4.1 植物体在形态水平上的变化14-15
  • 1.4.2 植物体在生理生化水平的变化15-17
  • 1.4.3 低磷应答信号网络17-18
  • 1.5 根际p H变化18-19
  • 1.6 氮与磷的关系19
  • 1.7 课题前期研究及立题意义19-21
  • 2 材料与方法21-37
  • 2.1 实验仪器21-22
  • 2.2 实验材料22
  • 2.2.1 植物材料22
  • 2.2.2 质粒载体22
  • 2.3 实验试剂22
  • 2.4 引物合成及DNA测序22-23
  • 2.5 常用培养基及溶液的配制23-27
  • 2.5.1 培养基的配制23-24
  • 2.5.2 常用溶液的配制24-25
  • 2.5.3 无机磷含量测定溶液25
  • 2.5.4 GUS染液试剂25
  • 2.5.5 GUS酶活测定溶液25-26
  • 2.5.6 考马斯亮蓝G250染色液26
  • 2.5.7 H~+-ATPase活性测定液26-27
  • 2.6 实验方法27-37
  • 2.6.1 拟南芥种植27
  • 2.6.2 根际酸化能力定量测定方法27-28
  • 2.6.3 溴甲酚紫指示剂培养基p H原位显示法28
  • 2.6.4 无机磷含量测定28
  • 2.6.5 花青素含量的测定28-29
  • 2.6.6 侧根密度统计方法29
  • 2.6.7 H~+-ATPase活性测定方法29
  • 2.6.8 GUS染色分析29-30
  • 2.6.9 GUS酶活定量测定30-31
  • 2.6.10 有机酸含量的测定31-32
  • 2.6.11 拟南芥基因组DNA提取方法32
  • 2.6.12 拟南芥总RNA提取32-33
  • 2.6.13 反转录制备拟南芥c DNA33
  • 2.6.14 目的基因片段的扩增33-34
  • 2.6.15 酶切产物的纯化34
  • 2.6.16 酶切产物的连接34-35
  • 2.6.17 重组质粒的鉴定35
  • 2.6.18 农杆菌侵染拟南芥35-37
  • 3 结果与分析37-61
  • 3.1 pdrad1-1 突变体突变基因的确定37-43
  • 3.1.1 低磷条件下pdrad1-1、pdrad1-2 的酸化能力弱于WT37-38
  • 3.1.2 PDRAD1转基因回补植株可以恢复突变体pdrad1-1 的酸化能力38-40
  • 3.1.3 转基因回补植株可以恢复pdrad1-1 的侧根密度和花青素含量40-41
  • 3.1.4 转基因回补植株的磷转运能力与WT一致41-43
  • 3.2 PDRAD1基因对低磷胁迫的响应43-52
  • 3.2.1 低磷诱导PDRAD1表达量上调43-44
  • 3.2.2 PDRAD1超表达株系鉴定及酸化表型分析44-45
  • 3.2.3 Na_3VO_4抑制根际酸化反应45-46
  • 3.2.4 低磷胁迫下超表达植株根部细胞质膜上H~+-ATP酶活性增强46-47
  • 3.2.5 低磷胁迫下植株体内和根系分泌物中有机酸含量分析47-51
  • 3.2.6 低磷胁迫下超表达株系根系形态发生显著改变51-52
  • 3.3 不同浓度氮源处理下突变体特征分析52-58
  • 3.3.1 不同浓度氮源处理下pdrad1-1 的酸化表型及定量分析52-54
  • 3.3.2 突变体pdrad1-1 的生物量和侧根密度低于WT54-56
  • 3.3.3 缺铵条件下pdrad1-1 的磷转运能力加强56-57
  • 3.3.4 低磷胁迫下植物组织中的铵含量积累57-58
  • 3.4 PDRAD1::p CAMBIA1300-GFP永久GFP载体的构建58-61
  • 4 讨论61-65
  • 4.1 PDRAD1调控低磷诱导下的根际酸化过程61-62
  • 4.2 PDRAD1影响了无机磷在植物体内的转运62
  • 4.3 PDRAD1影响植株根系形态建成62-65
  • 5 结论65-67
  • 参考文献67-73
  • 致谢73-74

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