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《河南大学》 2016年
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酿酒酵母三个耐盐相关基因克隆及其在棉花中转化

穆敏  
【摘要】:盐渍化是限制植物生长和农作物产量的一个重要因素。棉花是盐碱地的先锋作物,是开发利用盐渍化土地的理想作物之一。通过基因工程和转基因技术提高棉花耐盐性已经成为当前棉花育种的一个迫切需求和重要方向。相关研究表明,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中与耐盐相关的基因有200多个。其中,ENA1(exitu natru 1)基因编码一种P型盐诱导的ATPase,具有外排Na~+、Li~+的功能;转化拟南芥后,转基因拟南芥在酸碱条件下的耐盐性均有所提高。HAL1(halotolerance 1)基因是ENA1基因的效应子,通过提高反馈调节中K~+吸收的量来促进K~+的吸收;ScHAL1基因转化植物后不仅可以提高转基因植株的耐盐性,而且提高其耐碱性和作物产量。酿酒酵母YCF1(yeast cadmium factor 1)蛋白是液泡膜上S-谷胱甘肽结合转运蛋白,依赖于Mg-ATP,在重金属Cd~+、Hg~(2+)的转运解毒中起作用;转ScYCF1基因拟南芥在较高盐胁迫下比野生型对NaCl的耐受性强。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)As2.375为实验材料,通过NCBI数据库得到酿酒酵母耐盐相关基因ENA1、HAL1和YCF1的mRNA序列,利用RT-PCR技术克隆了三个基因。其中ENA1(GenBank:NM_001180348.1)基因全长3276 bp,编码1091个氨基酸;HAL1(GenBank:EF015596.1)基因全长885 bp,编码294个氨基酸;YCF1(GenBank:NM_001180442.3)基因全长4548 bp,编码1515个氨基酸。对三个基因编码的蛋白进行生物信息学分析发现,三个蛋白的等电点分别为5.53、9.01和8.64,ENA1蛋白呈酸性且带负电,HAL1和YCF1蛋白带正电荷呈碱性;亲疏水性分析结果表明,ENA1和HAL1蛋白表现为亲水性,而YCF1蛋白则是疏水性蛋白。同时,三个蛋白二级结构中都含有α螺旋、β-折叠片、β-转角和无规则卷曲。构建绿色荧光融合表达载体pBI121-ENA1::GFP、pBI121-HAL1::GFP和pBI121-YCF1::GFP,对三个基因进行洋葱内表皮亚细胞定位发现ENA1蛋白和YCF1蛋白在细胞膜上表达,而HAL1基因编码的蛋白则定位于表皮细胞的细胞质中。棉花花粉的瞬时表达分析中,基因枪轰击后花粉的绿色荧光都明显增强,证明三个基因在棉花花粉中表达,为下一步使用基因枪活体转化技术获得转基因耐盐材料奠定基础。利用基因枪技术将三个基因分别活体转化陆地棉(Gossypium hirsutum L.)材料中棉所12,并对收获的T1代转基因种子进行耐盐性筛选和分子检测。0.6%NaCl盐溶液胁迫下,转酿酒酵母ENA1、HAL1和YCF1基因的转基因种子的发芽率和根生长情况均优于对照中棉所12自交种,证明三个基因转化棉花后均可以明显提高种子耐盐性。对T1代转基因种子进行分子检测,以载体质粒为阳性对照,中棉所12自交种DNA为阴性对照,用所设计的检测引物分别扩增,将有特异性条带的PCR产物纯化后直接测序。通过比对分析测序结果,表明共得到转基因植株18棵,其中转ENA1基因3棵,转HAL1基因9棵,转YCF1基因6棵。本研究利用基因枪活体转化技术,将来源于酿酒酵母的三个耐盐相关基因ENA1、HAL1和YCF1分别转化棉花,初步鉴定出其可以提高棉花耐盐性,为进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的确切功能提供依据,同时为培育棉花耐盐的新品种提供基础材料。
【关键词】:酿酒酵母 盐胁迫 基因克隆 瞬时表达 分子检测
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-12
  • 缩写词12-13
  • 1 前言13-23
  • 1.1 植物的耐盐性13-15
  • 1.1.1 离子毒害及其调节13-14
  • 1.1.2 渗透调节及其抗性14
  • 1.1.3 抗氧化酶和植物激素调节14-15
  • 1.2 植物转基因技术15-16
  • 1.2.1 载体介导法15
  • 1.2.2 DNA直接导入法15-16
  • 1.2.3 花粉管通道法16
  • 1.3 外源基因转化棉花研究现状16-17
  • 1.4 酿酒酵母耐盐基因研究进展17-20
  • 1.4.1 ENA1基因研究进展18-19
  • 1.4.2 HAL1基因研究进展19-20
  • 1.4.3 YCF1基因研究进展20
  • 1.5 立题依据及技术路线20-23
  • 2 材料与方法23-31
  • 2.1 实验材料23-24
  • 2.1.1 实验棉花材料23
  • 2.1.2 实验仪器23-24
  • 2.1.3 实验菌株与载体质粒24
  • 2.2 实验方法24-31
  • 2.2.1 酵母RNA的提取24
  • 2.2.2 反转录制备cDNA24-25
  • 2.2.3 酵母耐盐相关基因的克隆25-26
  • 2.2.4 序列分析26
  • 2.2.5 表达载体的构建26
  • 2.2.6 洋葱表皮亚细胞定位26-27
  • 2.2.7 棉花花粉的瞬时表达分析27
  • 2.2.8 基因枪活体转化棉花27-28
  • 2.2.9 转基因棉花T1代种子耐盐性分析及分子检测28-31
  • 3 结果与分析31-49
  • 3.1 酵母耐盐相关基因的克隆31-32
  • 3.1.1 酵母RNA提取结果分析31
  • 3.1.2 酵母耐盐相关基因的克隆31-32
  • 3.2 生物信息学分析32-39
  • 3.2.1 ENA1基因的生物信息学分析32-33
  • 3.2.2 HAL1基因的生物信息学分析33-36
  • 3.2.3 YCF1基因的生物信息学分析36-39
  • 3.3 荧光表达载体的构建39
  • 3.4 基因瞬时表达分析39-40
  • 3.4.1 洋葱内表皮细胞的亚细胞定位39-40
  • 3.4.2 棉花花粉的瞬时表达分析40
  • 3.5 转基因棉花T1代种子耐盐性分析及分子检测40-49
  • 3.5.1 转基因棉花T1代种子的获得40-41
  • 3.5.2 转基因种子耐盐性分析41-43
  • 3.5.3 转基因种子分子检测43-49
  • 4 讨论49-53
  • 4.1 酿酒酵母耐盐基因转化植物的研究现状49-50
  • 4.2 基因瞬时表达分析50
  • 4.3 基因枪活体转化技术分析50-51
  • 4.4 转基因棉花分子检测51-53
  • 5 结论53-54
  • 参考文献54-64
  • 硕士期间发表论文64-65
  • 致谢65-66

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