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《河南大学》 2016年
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拟南芥叶绿素荧光相关突变体E1991的图位克隆及基因功能分析

孙灵睿  
【摘要】:植物的光合作用是维持地球生态平衡的重要一环,是食物链的物质基础。叶绿体是大部分光合自养生物进行同化作用的细胞器,其形态因植物种类不同而具有较大差异。作为一种半自主细胞器,其发育调控及信号转导网络极其复杂,不仅受核基因编码蛋白的调控,更受到自身基因表达的影响。正是由于这种复杂性,虽然其发育及调控一直备受关注,但其相关分子机制目前尚未完全明了。对其深入细微的研究,不仅仅可以满足人类的求知欲,更能广泛用于改良作物的农艺性状等,具有十分重要的指导意义。本研究以拟南芥为材料,使用甲基磺酸乙酯(ethylmethyl sulfonate,EMS)对Col-0野生型拟南芥种子进行处理,使其发生单碱基突变,发生表型的变化,从而构建突变体库。使用叶绿素荧光成像技术,筛选出叶绿素荧光参数F_0和F_m均偏高,F_v/F_m较低的一种突变体,命名为E1991。对其生长表型研究发现,该突变体在萌发上对ABA处理不敏感,营养生长期较WT长,滞绿,且真叶的叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素含量均偏高。通过遗传试验分析,确认该突变体属于单基因隐性突变。与Landsberg野生型杂交后自交,构建F_2代分离群体,使用图位克隆的方式将突变位点定位在F3F19 BAC(Bacteria Artificial Chromosome)附近,并通过基因比对,找到了突变基因CFNY。该基因第95位碱基由G突变为A,对应编码的氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸。CFNY的表达结构由7个内含子和8个外显子构成,编码一个功能未知的蛋白。为研究该基因的功能以及在该基因表达中的组织定位与亚细胞定位,我们分别构建了回补、超表达、1391-GUS、永久GFP载体与瞬时GFP载体。研究结果表明,CFNY是与拟南芥叶绿体发育相关的一个未知基因,可能参与植物衰老及光合生理信号调控。亚细胞定位结果显示,该基因可能定位于细胞内膜及叶绿体外膜结构附近,该试验结果还需进一步共定位进行确认。对相关基因的表达进行实时定量PCR检验,发现突变体E1991和超表达植株中,CAB表达量均有所下调,而RBCS表达量有一定的上调。其相关信号通路还有待进一步探索。
【关键词】:拟南芥 叶绿素荧光 图位克隆 功能分析
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-8
  • 缩写词(Abbreviation)8-12
  • 1 前言12-23
  • 1.1 叶绿体的发育研究进展12-13
  • 1.1.1 叶绿体研究概述12
  • 1.1.2 多因素影响叶绿体发育12-13
  • 1.2 叶绿素的代谢13-17
  • 1.2.1 叶绿素的合成代谢13-14
  • 1.2.2 叶绿素的分解代谢14-16
  • 1.2.3 光合色素与植物衰老16-17
  • 1.3 光系统与能量代谢17-19
  • 1.3.1 光系统Ⅰ与光系统Ⅱ17-18
  • 1.3.2 非光化学淬灭18-19
  • 1.4 叶绿素荧光参数的研究进展19-23
  • 1.4.1 叶绿素荧光机理和测量19-20
  • 1.4.2 叶绿素荧光参数的生物学意义20-23
  • 2 立题依据23-24
  • 3 材料与方法24-42
  • 3.1 常用仪器24
  • 3.2 实验材料、载体和菌株24-25
  • 3.2.1 植物实验材料24
  • 3.2.2 实验载体与菌株24-25
  • 3.3 实验药品和试剂25
  • 3.4 常用培养基和溶液的配制25-27
  • 3.4.1 常用培养基的配制25-26
  • 3.4.2 溶液的配制26-27
  • 3.4.3 抗生素的配制27
  • 3.5 实验方法27-42
  • 3.5.1 拟南芥的培养27-28
  • 3.5.2 拟南芥的杂交28
  • 3.5.3 拟南芥DNA的提取28-29
  • 3.5.4 可溶性蛋白提取和含量的测定29
  • 3.5.5 可溶性总糖提取和含量的测定29-30
  • 3.5.6 叶绿素提取和含量的测定30
  • 3.5.7 Trizol法提取拟南芥RNA30-31
  • 3.5.8 反转录制备拟南芥cDNA31
  • 3.5.9 PCR引物的设计31-33
  • 3.5.10 载体构建与重组质粒的鉴定33-34
  • 3.5.11 琼脂糖凝胶的配制与回收34-35
  • 3.5.12 T-DNA插入突变体的纯合鉴定35
  • 3.5.13 大肠杆菌感受态细胞的制备35-36
  • 3.5.14 质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞36-37
  • 3.5.15 农杆菌感受态细胞的制备37
  • 3.5.16 质粒DNA转化农杆菌感受态细胞37
  • 3.5.17 重组菌落与质粒的鉴定37-38
  • 3.5.18 质粒DNA的小量提取38
  • 3.5.19 农杆菌侵染38
  • 3.5.20 转基因植株的筛选38-39
  • 3.5.21 GUS染色方法39
  • 3.5.22 图位克隆39-40
  • 3.5.23 瞬转40-42
  • 4 结果与分析42-55
  • 4.1 突变体的获得42
  • 4.2 突变体的遗传学分析42-43
  • 4.3 突变体的图位克隆43-46
  • 4.3.1 F2代分离群体的构建43-44
  • 4.3.2 基因粗定位结果44
  • 4.3.3 基因细定位结果44-45
  • 4.3.4 基因测序结果45-46
  • 4.3.5 Salk line突变体表型分析46
  • 4.4 突变体E1991的发育表型46-49
  • 4.4.1 E1991突变体与Col-0 野生型叶绿素含量的测定46-47
  • 4.4.2 E1991突变体与Col-0 野生型可溶性蛋白含量的测定47
  • 4.4.3 E1991突变体与Col-0 野生型可溶性总糖含量的测定47-48
  • 4.4.4 ABA处理下的萌发差异48-49
  • 4.4.5 相关基因的表达分析49
  • 4.5 回补载体的构建与回补植株的筛选49-51
  • 4.5.1 回补载体E1991::pCAMBIA1300-COM的构建49-50
  • 4.5.2 回补植株的筛选50
  • 4.5.3 回补植株的表型分析50-51
  • 4.6 超表达载体E1991::p-S1300+的构建51
  • 4.7 E1991::GFP载体的构建51-53
  • 4.7.1 E1991::pHBT-GFP-NOS载体的构建及原生质体转化51-52
  • 4.7.2 E1991::S1300+-GFP载体的构建及原生质体转化52-53
  • 4.8 E1991::pCAMBIA1391-GUS载体的构建53
  • 4.9 蛋白原核表达载体的构建53-55
  • 5 讨论55-57
  • 结论57-58
  • 参考文献58-65
  • 致谢65-66

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