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《河南大学》 2016年
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节节麦二氢黄酮-4-还原酶基因的克隆与功能分析

陈瑞金  
【摘要】:干旱是导致作物减产的主要原因,从野生近缘属种质资源中发掘可利用的抗旱基因,研究其与植物抗旱性的关系,对选育抗旱的小麦品种具有重要意义。作为普通小麦的二倍体祖先种,节节麦(Aegilops tauschii,DD)含有丰富的抗生物和非生物胁迫的优良基因资源。课题组前期通过苗期抗旱性鉴定和转录组分析发现,新疆节节麦XJ2和XJ98的二氢黄酮-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)基因的表达水平存在显著差异。为揭示DFR基因与植物抗旱性的关系,本研究对两份节节麦的DFR基因进行克隆、功能预测、体外表达和荧光定量PCR表达分析,并对旱胁迫前后XJ2的DFR粗提液的酶促动力学进行分析,以期为抗旱节节麦种质资源在培育抗旱小麦品种过程中的有效利用奠定基础。实验结果如下:(1)苗期旱胁迫前后节节麦XJ2和XJ98的DFR基因表达的实时荧光定量PCR比较分析表明,与转录组分析结果一致,干旱胁迫诱导使XJ2的DFR基因表达显著上调,而XJ98的转录水平没有显著变化。(2)对两份节节麦的DFR基因的克隆序列分析表明,从节节麦XJ2和XJ98中克隆的DFR基因均有6个外显子和5个内含子组成,但XJ98的DFR基因外显子序列中缺失了8个核苷酸而成为假基因。XJ2中克隆的DFR基因可编码由347个氨基酸残基组成的多肽,与大麦的DFR基因有最高的相似性(95%)。对其生物信息学的分析表明,该基因编码的蛋白可能为疏水性蛋白,二级结构元件主要是α螺旋和无规卷曲,功能结构域中包括短链脱氢/还原酶(SDR)家族位点,属于NADB-Rossmann超家族的新成员。(3)HPLC法检测干旱胁迫前后XJ2的DFR粗酶液的酶促反应结果表明,干旱胁迫处理使DFR的酶促反应有明显的产物峰出现,推测DFR基因在干旱胁迫条件下对植物的抗旱性起到一定的作用。(4)实验成功构建了DFR基因的原核和真核表达载体,通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析表明,0.2 mmol/L的IPTG能成功诱导DFR基因的表达,且诱导5 h后蛋白表达量趋于稳定。
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2

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