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《河南大学》 2016年
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节节麦二氢黄酮-4-还原酶基因的克隆与功能分析

陈瑞金  
【摘要】:干旱是导致作物减产的主要原因,从野生近缘属种质资源中发掘可利用的抗旱基因,研究其与植物抗旱性的关系,对选育抗旱的小麦品种具有重要意义。作为普通小麦的二倍体祖先种,节节麦(Aegilops tauschii,DD)含有丰富的抗生物和非生物胁迫的优良基因资源。课题组前期通过苗期抗旱性鉴定和转录组分析发现,新疆节节麦XJ2和XJ98的二氢黄酮-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)基因的表达水平存在显著差异。为揭示DFR基因与植物抗旱性的关系,本研究对两份节节麦的DFR基因进行克隆、功能预测、体外表达和荧光定量PCR表达分析,并对旱胁迫前后XJ2的DFR粗提液的酶促动力学进行分析,以期为抗旱节节麦种质资源在培育抗旱小麦品种过程中的有效利用奠定基础。实验结果如下:(1)苗期旱胁迫前后节节麦XJ2和XJ98的DFR基因表达的实时荧光定量PCR比较分析表明,与转录组分析结果一致,干旱胁迫诱导使XJ2的DFR基因表达显著上调,而XJ98的转录水平没有显著变化。(2)对两份节节麦的DFR基因的克隆序列分析表明,从节节麦XJ2和XJ98中克隆的DFR基因均有6个外显子和5个内含子组成,但XJ98的DFR基因外显子序列中缺失了8个核苷酸而成为假基因。XJ2中克隆的DFR基因可编码由347个氨基酸残基组成的多肽,与大麦的DFR基因有最高的相似性(95%)。对其生物信息学的分析表明,该基因编码的蛋白可能为疏水性蛋白,二级结构元件主要是α螺旋和无规卷曲,功能结构域中包括短链脱氢/还原酶(SDR)家族位点,属于NADB-Rossmann超家族的新成员。(3)HPLC法检测干旱胁迫前后XJ2的DFR粗酶液的酶促反应结果表明,干旱胁迫处理使DFR的酶促反应有明显的产物峰出现,推测DFR基因在干旱胁迫条件下对植物的抗旱性起到一定的作用。(4)实验成功构建了DFR基因的原核和真核表达载体,通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析表明,0.2 mmol/L的IPTG能成功诱导DFR基因的表达,且诱导5 h后蛋白表达量趋于稳定。
【关键词】:节节麦 二氢黄酮-4-还原酶(DFR)基因 克隆 表达分析
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-5
  • ABSTRACT5-7
  • 缩写词(Abbreviations)7-10
  • 1 前言10-20
  • 1.1 节节麦的研究进展10-12
  • 1.1.1 节节麦10-11
  • 1.1.2 节节麦D基因组的研究进展11
  • 1.1.3 节节麦的生物和非生物抗性11
  • 1.1.4 节节麦在小麦遗传改良中的应用11-12
  • 1.2 植物中的类黄酮化合物12-15
  • 1.2.1 类黄酮化合物与植物的抗逆性12-13
  • 1.2.2 植物中的花青素13-15
  • 1.3 二氢黄酮4还原酶(DFR)基因的研究进展15-17
  • 1.3.1 DFR基因的生物信息学分析15
  • 1.3.2 DFR基因的底物特异性15-16
  • 1.3.3 DFR基因的作用机制16
  • 1.3.4 DFR基因的调控机制16-17
  • 1.4 本研究的目的和意义17-20
  • 2 材料与方法20-32
  • 2.1 实验材料20-21
  • 2.1.1 植物材料20
  • 2.1.2 菌株与载体20
  • 2.1.3 主要药品与试剂20
  • 2.1.4 常用溶液及培养基20-21
  • 2.2 实验方法21-32
  • 2.2.1 CTAB法提取植物基因组DNA21-22
  • 2.2.2 Trizol法提取植物RNA22
  • 2.2.3 cDNA第一链的合成22-23
  • 2.2.4 DFR基因cDNA和DNA的克隆23-25
  • 2.2.5 DFR的生物信息学分析25-26
  • 2.2.6 HPLC法检测DFR的酶促动力学反应26
  • 2.2.7 DFR基因的原核诱导表达及分析26-29
  • 2.2.8 DFR基因的植物表达载体的构建29-30
  • 2.2.9 农杆菌介导的拟南芥遗传转化30-32
  • 3 结果与分析32-44
  • 3.1 DFR基因的实时荧光定量PCR检测32
  • 3.2 DFR基因的克隆、序列比较分析和生物信息学分析32-37
  • 3.2.1 DFR基因的克隆32-33
  • 3.2.2 DFR基因的序列比较分析33-36
  • 3.2.3 DFR基因的生物信息学分析36-37
  • 3.3 DFR的酶促动力学分析37-39
  • 3.4 DFR基因的表达分析39-44
  • 3.4.1 DFR基因的原核表达和免疫杂交分析39-41
  • 3.4.2 DFR基因的植物表达载体的构建41-44
  • 4 讨论44-46
  • 5 结论46-48
  • 参考文献48-56
  • 致谢56-57

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