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《河南大学》 2016年
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棉铃虫C型凝集素抑制HaNPV增殖的分子机制研究

苗迎春  
【摘要】:棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种世界范围内的杂食性害虫,不仅危害棉花,还危害玉米、小麦等多种作物及番茄、辣椒等蔬菜。近年来,转基因棉花品种的培育,对于控制棉铃虫害发挥了巨大的作用,但是随着BT转基因棉的长期和大量种植,田间棉铃虫已开始产生抗性,因而对棉铃虫的防治仍然非常紧迫。核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis viruses,NPV)是一类具有很强专一性宿主的病毒,因其安全性高、持效期长、对环境友好,因此是最早一类被批准用于生物防治的病毒杀虫剂类农药。棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera NPV,HaNPV)专一性寄生于棉铃虫,作为棉铃虫特异性病原致死病毒,是成功制约棉铃虫种群数量的一个重要因子,但这类病毒的体内传播机制目前仍不清楚。当生物体遭遇病毒侵染时,模式识别受体对非己成分的有效识别是机体免疫反应最早和最关键一步。C型凝集素(C-type lectin)作为重要模式识别受体之一,其通过识别存在于微生物表面的病源相关分子,在先天免疫反应中发挥关键作用。实验室前期研究结果证实棉铃虫C型凝集素Ha-lectin能够抑制核型多角体出芽型病毒(Budding virus,BV)在棉铃虫体内的增殖,但其抑制机制未知。当棉铃虫受到HaNPV感染后,不仅Ha-lectin在颗粒细胞中剧烈上调,且在病毒感染的浆血细胞中被诱导表达。荧光标记包涵体病毒(Occlusion derived virus,ODV),显示二者在血细胞中存在共定位。而BV体内感染和增殖速度决定宿主的死亡和杀虫剂的起效时间,因而研究内容将从宿主体内蛋白和病毒蛋白互作的角度,揭示Ha-lectin抑制BV增殖的分子机制。本实验中定量检测了棉铃虫由胞外血清中Ha-lectin蛋白触发的直接对病毒的分解,发现血清中Ha-lectin蛋白能够促进病毒的分解。灭活的血清、Ha-lectin dsRNA干扰后的血清以及加入Ha-lectin抗体的血清,与正常血清相比对病毒的分解能力减弱。病毒吸附法检测了Ha-lectin对出芽病毒BV吸附宿主细胞能力的影响,结果显示Ha-lectin能够促进病毒对血细胞的吸附。但是在脂肪体细胞中,HaNPV出芽病毒BV与不同处理的血清孵育后,正常血清孵育的病毒对脂肪体细胞的吸附能力与RNAi干扰后的血清、加入Ha-lectin抗体的血清孵育的病毒相比,病毒对脂肪体的吸附能力变化不显著。说明脂肪体与血细胞不同,在脂肪体中Ha-lectin不能促进病毒对脂肪体细胞的吸附。另外还检测了HaNPV出芽病毒BV在血细胞和脂肪体内的增殖状况,在脂肪体内病毒增殖比在血细胞内快,说明在血细胞中抑制了病毒的增殖。棉铃虫C型凝集素可能发挥了调理素的作用,促进病毒对血细胞的吸附、并抑制病毒在血细胞内的增殖。为进一步揭示C型凝集素对HaNPV的作用机制,运用免疫共沉淀联合质谱方法研究在BV病毒感染过程中可能与Ha-lectin互作的蛋白。感染病毒和未感染病毒的棉铃虫血淋巴蛋白质分析比较,结果出现35个蛋白组、45个蛋白,分别为免疫相关蛋白、调节子蛋白、水解酶类和组织蛋白等。推测血淋巴中的水解酶和免疫蛋白可能参与了病毒分解和对血细胞的吸附,从而抑制病毒增殖。病毒可能和胞膜没有发生直接互作,而是先和宿主开放血腔中的C型凝集素形成蛋白复合体,经由C型凝集素识别胞膜受体,促进病毒进入细胞并在细胞内抑制病毒增殖。为寻找能够与HaNPV病毒和C型凝集素复合体结合的胞膜受体,提取了棉铃虫血细胞膜蛋白,用免疫共沉淀结合质谱方法对膜上蛋白进行分析。所得数据为病毒在棉铃虫体内传播机制的研究,尤其是为病毒感染的早期阶段确认NPV感染的关键因子,提供重要的依据和线索。为提高生物农药的杀虫效果和发现新的害虫防治靶标奠定工作基础,具有较大的应用价值和实践意义。
【关键词】:棉铃虫 C型凝集素 棉铃虫核型多角体病毒
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S433
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-9
  • 缩略词表9-12
  • 1 前言12-20
  • 1.1 研究背景12-13
  • 1.2 研究现状13-17
  • 1.2.1 哺乳动物C型凝集素在病毒感染中的作用13-14
  • 1.2.2 无脊椎动物C型凝集素在病毒感染中的作用14-15
  • 1.2.3 昆虫相关免疫蛋白的研究15-17
  • 1.3 免疫共沉淀联合质谱技术的应用17-18
  • 1.4 本研究的意义与创新之处18-20
  • 2 材料与方法20-36
  • 2.1 实验材料20-23
  • 2.1.1 昆虫20
  • 2.1.2 菌株与病毒20
  • 2.1.3 实验试剂20-21
  • 2.1.4 常用试剂的配置21-23
  • 2.1.5 主要实验仪器23
  • 2.2 方法23-36
  • 2.2.1 引物设计与合成23-24
  • 2.2.2 Ha-lectin1重组质粒提取24-25
  • 2.2.3 PCR扩增25
  • 2.2.4 回收PCR产物25
  • 2.2.5 合成dsRNA25-26
  • 2.2.6 dsRNA处理棉铃虫26-27
  • 2.2.7 棉铃虫血细胞RNA提取27
  • 2.2.8 SMART cDNA的合成27-28
  • 2.2.9 Ha-Lectin基因扩增28-29
  • 2.2.10 定量检测RNAi后Ha-Lectin的表达29
  • 2.2.11 HaNPV重组质粒提取29-30
  • 2.2.12 HaNPV绝对定量标准曲线的建立30
  • 2.2.13 血清中病毒分解检测30
  • 2.2.14 病毒对血细胞的吸附检测30-31
  • 2.2.15 病毒对脂肪体的吸附检测31
  • 2.2.16 病毒在血细胞和脂肪体内增殖检测31
  • 2.2.17 HaNPV重组蛋白包涵体复性31-32
  • 2.2.18 HaNPV重组蛋白纯化32
  • 2.2.19 HaNPV多克隆抗体的制备32-33
  • 2.2.20 血淋巴蛋白免疫共沉淀33
  • 2.2.21 Western-blotting33-34
  • 2.2.22 质谱分析34-35
  • 2.2.23 血细胞膜蛋白提取35
  • 2.2.24 免疫共沉淀联合质谱35-36
  • 3 实验结果与分析36-52
  • 3.1 Ha-Lectin干扰结果分析36-39
  • 3.1.1 Ha-Lectin重组质粒提取检测36
  • 3.1.2 PCR引物扩增36-37
  • 3.1.3 PCR回收产物检测37
  • 3.1.4 合成的dsRNA检测37
  • 3.1.5 dsRNA处理后棉铃虫血细胞RNA的提取检测37-38
  • 3.1.6 Ha-Lectin扩增结果38
  • 3.1.7 Ha-Lectin沉默效果检测38-39
  • 3.2 HaNPV绝对定量标准曲线的建立39-40
  • 3.2.1 HaNPV重组质粒的提取及检测39
  • 3.2.2 建立HaNPV绝对定量标准曲线39-40
  • 3.3 Ha-Lectin在HaNPV感染过程中的作用研究40-43
  • 3.3.1 血清中Ha-Lectin对病毒的分解作用检测40-41
  • 3.3.2 Ha-Lectin对病毒与血细胞的吸附影响检测41-42
  • 3.3.3 Ha-Lectin对病毒与脂肪体细胞的吸附影响检测42-43
  • 3.3.4 Ha-Lectin对病毒在血细胞和脂肪体细胞内的增殖影响检测43
  • 3.4 免疫共沉淀联合质谱筛选与Ha-Lectin和NPV复合体互作蛋白43-52
  • 3.4.1 HaNPV重组蛋白纯化检测43-44
  • 3.4.2 血淋巴免疫共沉淀结果44
  • 3.4.3 Western-blotting检测HaNPV蛋白44-45
  • 3.4.4 质谱结果45-48
  • 3.4.5 膜蛋白免疫共沉淀结果48
  • 3.4.6 膜蛋白质谱结果48-52
  • 4 讨论52-56
  • 4.1 Ha-Lectin对HaNPV的作用52-53
  • 4.2 Ha-Lectin和HaNPV复合体互作蛋白分析53-56
  • 参考文献56-64
  • 致谢64-66
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录66-67

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