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《河南大学》 2016年
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CRISPR/Cas9系统介导的印记基因敲除小鼠制备的研究

袁晓立  
【摘要】:基因组编辑技术尤其是新兴的CRISPR/Cas9系统,能高效地对基因组进行靶向修饰,理论上可以实现任何物种任何基因的编辑,对生命科学、医学等都展示出巨大的研究价值。传统的基因打靶技术依赖于DNA片段的同源重组,效率低(低于10-6)。相对于ZFNs和TALENs的复杂组装,CRISPR/Cas9系统依靠guide RNA和Cas9蛋白就可以实现基因定点编辑,具有构建简单、打靶效率高、成本低等优点。本实验设计利用CRISPR/Cas9系统分别在小鼠ES细胞和胚胎水平实现基因定点敲除,并获得单等位基因敲除小鼠模型。本课题以小鼠母源印记基因Kcnq1ot1作为敲除对象。该基因位于Kcnq1ot1印记基因簇中并起调控作用。本课题第一条技术路线为ES细胞介导的囊胚注射法制备转基因小鼠,策略为敲除Kcnq1ot1启动子以及其起始部位共3.7 kb长DNA片段,并敲入puroeGFP。在敲除片段5’和3’端各找了3个靶位点并成功构建基于靶位点的6个gRNA和打靶载体Kcnq1ot1-puro-eGFP-pGalk。将打靶载体、Cas9表达质粒和5’gRNA-1及3’gRNA-1共转染至小鼠ES细胞,得到单等位基因敲除ES细胞株。将单等位基因敲除细胞株扩大培养以后进行囊胚注射。采用CD1小鼠作为供胚鼠,共注射1836枚囊胚,移植826枚,共出生138只小鼠,出生率为16.7%,成功获得4只嵌合体小鼠,但没有生殖系嵌合。第二条技术路线采用受精卵原核注射法制备转基因小鼠。同样敲除3.7 kb长DNA片段,敲入mCherry荧光报告基因。为了增加同源重组效率,我们将同源臂长度提高至1.5 kb,构建了基于受精卵的打靶载体Kcnq1ot1-mCherry-pGEM-3CZF。通过本实验室建立的荧光报告基因法在质粒水平检测了6个gRNA位点同源重组修复效率,筛选出同源重组效率较高的5’gRNA-2、3’gRNA-3和打靶载体及Cas9表达质粒进行原核注射。供胚鼠为D6B2F1,共注射583枚胚胎,移植327枚,出生66只,出生率20%。因同源重组修复效率低,经初步鉴定,未发现阳性鼠,目前准备增加注射胚胎的数量以获得基因敲除小鼠。
【关键词】:CRISPR/Cas9 基因敲除 显微注射 印记基因
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78
【目录】:
  • 摘要4-5
  • ABSTRACT5-9
  • 1 引言9-23
  • 1.1 基因组编辑技术9-15
  • 1.1.1 锌指核酸酶技术10-11
  • 1.1.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术11-12
  • 1.1.3 CRISPR/Cas9系统12-15
  • 1.2 几种常用的动物转基因技术15-17
  • 1.2.1 胚胎干细胞介导的囊胚注射法15-16
  • 1.2.2 基于受精卵的原核注射或胞质注射16
  • 1.2.3 体细胞核移植16-17
  • 1.3 基因组编辑技术的应用17-19
  • 1.3.1 研究基因功能17
  • 1.3.2 基因治疗17-18
  • 1.3.3 制备医学动物疾病模型18
  • 1.3.4 利用基因组编辑技术改良动物遗传性状18-19
  • 1.4 印记基因和细胞重编程19-21
  • 1.5 立题依据和研究意义21-23
  • 2 材料与方法23-43
  • 2.1 材料23-31
  • 2.1.1 载体23
  • 2.1.2 菌株、细胞系和小鼠品系23
  • 2.1.3 主要试剂23-25
  • 2.1.4 主要仪器25-26
  • 2.1.5 常用培养基和缓冲液的配制26-30
  • 2.1.6 引物序列(金唯智)30-31
  • 2.2 实验方法31-43
  • 2.2.1 打靶载体的制备31-35
  • 2.2.2 gRNA的构建35-37
  • 2.2.3 小鼠成纤维细胞的制备37-38
  • 2.2.4 小鼠ES细胞培养38
  • 2.2.5 小鼠ES细胞电转染38-39
  • 2.2.6 阳性ES细胞筛选39-40
  • 2.2.7 ES细胞介导的囊胚注射及子宫移植40-41
  • 2.2.8 受精卵介导的原核注射及输卵管移植41-43
  • 3 结果与分析43-51
  • 3.1 ES细胞介导的敲除小鼠制备结果43-47
  • 3.1.1 ES细胞水平CRISPR/Cas9系统介导的Kcnq1ot1基因敲除43-44
  • 3.1.2 gRNA构建结果44-45
  • 3.1.3 囊胚注射及嵌合体小鼠45-47
  • 3.2 受精卵原核注射介导的敲除小鼠制备的结果47-51
  • 3.2.1 胚胎水平载体构建及gRNA效率检测结果47-49
  • 3.2.2 原核注射结果49-51
  • 4 讨论51-53
  • 4.1 关于CRISPR/Cas9系统51-52
  • 4.2 制作动物模型方法的比较52
  • 4.3 动物模型52-53
  • 5 结论53-55
  • 参考文献55-61
  • 致谢61-63
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录63-64

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