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腈水合酶高产菌的基因组重排育种及其发酵过程控制的研究

王丽娟  
【摘要】:腈水合酶是一种催化丙烯腈产生丙烯酰胺的酶类,该酶的活性大小是微生物法生产丙烯酰胺的关键,直接影响着丙烯酰胺的产量、质量和经济效益。丙烯酰胺(Acrylamide,AM)是一种重要的精细有机化工原料,主要是用来生产聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺作为絮凝剂、增稠剂、增强剂等,被广泛用于石油开采、水处理、造纸、印染、煤炭等许多经济领域,并在食品、制糖、医药等行业有着广泛应用。随着丙烯酰胺的需求量不断增大,在腈水合酶产生菌方面的研究已成为一个热点,国内外的学者在腈水合酶产生菌的分离选育、酶的形成条件和发酵优化等方面做了大量工作,并取得了可喜的成果。近年来,学者们对腈水合酶的分子结构和性质进行了深入研究,从分子水平上揭示了腈水合酶的催化机理,这些性质的研究对提高酶的催化活性和稳定酶有重要的意义。 优良菌种选育技术是发酵工程的核心技术。常规的诱变育种方法是以紫外线、辐射或化学诱变剂处理微生物(基因组),产生大量突变,然后以所需指标进行筛选。由于负突变的比例非常高,一般要筛选 10000 个突变体才能发现一个正突变。经过长期诱变获得的菌株在特定性状有所改善的同时,也往往积累了很多不直接和特定性状关联的有害突变,比如生长条件要求苛刻,生存能力变差,细胞变“脆弱”等。杂交育种选用已知性状的供体和受体菌株作为亲本,因此无论在方向性还是自觉性方面,都比诱变育种前进了一大步。但由于杂交育种的方法较复杂,工作进度较慢,因此还很像诱变育种技术培育高产菌株的例子还不多见。分子育种(molecular breeding)继承和发展了杂交育种,引起新的概念和方法加速了育种进度。因此它的应用前景很广,可以用于基因,代谢甚至全基因组的育种。 本文采用的 genome shuffling(基因组重排)的分子育种对象是整个细胞,它能弥补诱变育种的不足,把通过诱变育种改良的突变株进行杂交育种,使得不同菌株来源的基因组能够得到充分的重组,不同正向突变整合到同一重组子中的机会大大增加,同时积累的有害突变可被其它菌株的野生型序列所代替,由此得到一批性能改善的重组子被高通量检出,再进入下一轮的基因组重排,大大提高了正变率。 本课题以腈水合酶(Nitrile Hydratase)产生菌----诺卡氏菌(Nocardia sp.)HD9611 为出发菌株,以抗生素抗性为标记,通过原生质体的制备、原生质体的微波诱变、原生质体反复


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