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《河南大学》 2007年
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拟南芥幼苗的超低温保存及其遗传变异研究

何艳霞  
【摘要】: 超低温保存技术是长期稳定的保存植物种质资源的有效方法之一。玻璃化法超低温保存操作简单,适用材料广泛,保存效果好。本研究以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,对其幼苗的玻璃化法超低温保存条件进行了进一步优化,并通过形态观察和分子标记技术对超低温保存处理前后材料的遗传稳定性进行了比较研究。主要研究结果如下: 1.进一步优化了拟南芥幼苗玻璃化法超低温保存的程序,成活率可达92%以上。萌发1~2 d的幼苗室温下预处理(2 mol/L甘油+ 0.4 mol/L蔗糖)20 min,然后,换成玻璃化保护液PVS2(30%甘油+ 15% DMSO + 15%乙二醇+ 0.4mol/L蔗糖的MS培养基)于冰水混合物中处理50~60 min,立即投进液氮中保存,恢复时,先在40℃水浴中迅速化冻(不断摇晃),接着用洗涤液(含1.2 mol/L蔗糖的MS液体培养基)洗涤20~30 min,每10 min换一次洗涤液,最后转接到新的MS培养基上置入温室培养。5 d后统计成活率,10 d后移栽到培养土(蛭石:营养土=1:1)中培养,60 d后收获种子。 2.对超低温保存处理的苗和对照的生长发育进行形态观察比较。所有处理过的苗(包括在液氮中冷冻过的和未冷冻的)在恢复处理两天内生长都很缓慢,而对照组幼苗则生长很快。经过超低温保存处理但未经受液氮冷冻和化冻的幼苗几乎全部成活(达98%),而那些经过完整超低温保存处理的幼苗,化冻恢复后成活率下降到93.8%。前20 d,对照组的苗与两个处理组的苗相比生长较快,随后差异减小,至抽薹期三组样品的植株形态大小基本一致,均正常开花、结实。 3.应用扩增片段长度多态性(AFLP)技术对处理过的及对照组的幼苗基因组DNA进行分析。EcoRⅠ和MseⅠ对基因组DNA进行双酶切,用7对引物组合共扩增出549条带,在3组样品间未发现有差异片段出现。表明在超低温保存处理过程中没有造成保存材料基因组DNA序列的变化。 4.运用甲基敏感扩增多态性(MSAP)标记分析了处理样品与对照组样品间及其第二代的甲基化水平情况。MspⅠ和HapⅡ分别与EcoRⅠ结合对基因组DNA进行双酶切,在扩增的662条MSAP带中,有64条在样品间表现出不一致,其中有48条体现为处理与对照间不一致但是都与其第二代保持着一致。就第一代的3组样品的带型分析,液氮冷冻过的样品与对照或非冷冻处理的样品相比较,均有新产生的甲基化和脱甲基化出现,但是脱甲基化为主要趋势。
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