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《河南师范大学》 2010年
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性别决定基因家族成员-2基因sox_2对大鼠肝再生的作用研究

朱秋实  
【摘要】:性别决定基因家族成员-2 sox_2是SOX基因家族成员之一,与发育及细胞的分化与去分化相关。受sox_2在诱导多能性干细胞相关方面研究的启发,本文以大鼠再生肝为材料,用液压转基因技术(hydrodynamics-based transgene, HDT),通过基因过表达和RNA干涉的方法,初步研究了sox_2对大鼠肝再生过程的作用,为增加对sox_2在大鼠肝再生中的作用和分子机理的认识提供了资料。 本文根据已发布的信息对sox_2进行了克隆,并从其基因序列上挑选了两处靶位点设计了两条干涉RNA片段,将这些经检测正确的片段分别连接在真核表达载体pEGFP-N1和干涉载体pGenesil-1.0上,构建了一条重组表达载体pEGFP-N1- sox_2及两条重组干涉载体pGenesil-1.0-s199和pGenesil-1.0-s370。而后,双酶切表达载体pEGFP-N1- sox_2得到sox_2的ORF,将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-s199和pGenesil-1.0-s370上,构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-s199-sox_2、pGenesil-1.0-s370-sox_2。将构建成功的各检验载体分别对再生肝模型大鼠进行液压转基因,并于转基因后0、6、12、24、36、48、60、72和84h观察转干涉检验载体pGenesil-1.0-s199-sox_2、pGenesil-1.0-s370-sox_2后的绿色荧光蛋白阳性细胞率(转染率)与对照检验载体pGenesil-1.0-hk-sox_2相比是否有明显下降,以此来判断设计的干涉片段是否对靶位点具有干涉作用。将表达载体和干涉载体分别进行液压转基因操作,通过各载体的转染率找出其在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点,并结合sox_2在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点,得出该基因在大鼠部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后的最佳转基因时间。根据以上结果,利用大鼠肝再生模型和液压转基因技术展开了sox_2对大鼠肝再生作用的研究。将转基因后的再生肝材料分别于PH后72、120和168h取出,用荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术对大鼠肝脏组织形态结构、表达动力学和肝指数等方面的结果进行观察与分析。经过检测sox_2克隆成功,其表达载体、干涉载体和检验载体构建亦成功。经过对转 干涉检验载体pGenesil-1.0-s199-sox_2、pGenesil-1.0-s370-sox_2和对照检验载体pGenesil-1.0-hk-sox_2后转染率的检测,针对两处靶位点设计的两条干涉片段均具有较明显的干涉作用,其中尤以干涉片段s370的干涉效果最佳。经过对转表达载体和干涉载体后转染率的检测,并结合sox_2在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点,在PH后0h进行转基因效果最佳。对大鼠死亡率、组织形态结构、表达动力学和再生肝肝指数等方面的结果统计分析后显示:转干涉载体pGenesil-1.0-s370后,大鼠再生肝肝指数与对照相比有一定变化。
【学位授予单位】:河南师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q343

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