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《河南师范大学》 2018年
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circ_1366调节大鼠正常肝细胞株BRL-3A增殖的机理研究

陈延慧  
【摘要】:研究表明,circRNA是一类普遍存在于各种生物细胞中能够调控基因表达的内源性非编码RNA。circRNA能充当miRNA海绵,调控基因转录,和RNA结合蛋白互作,翻译合成蛋白质。已有研究表明circRNA作为内源竞争性RNA参与基因的表达与调控,与组织生长发育及某些疾病有关,如动脉粥样硬化、神经系统疾病以及朊病毒类疾病等,尤其在肿瘤的发生、发展、诊断等研究方面具有深远的潜在价值。然而,有关调节大鼠肝再生的circRNA报道甚少,它们在肝再生中可能发挥的功能需要进一步深究。为此,该课题完成了大鼠2/3肝切除后0h、2h与6h再生肝circRNA的高通量测序及生物信息学分析,共发现2412种circRNA。根据GO分析和KEGG功能富集分析,推测了circRNA可能参与的生理活动。其中,多种circRNA与细胞的增殖、存活和死亡等生理活动有着必要的联系。依据高通量测序的数据分析结果及相关的转录组和蛋白组芯片的数据结果,初次得到实验组共有159种circRNA在大鼠2/3肝切除后的再生肝中差异表达发生显著变化,上调96种,下调61种,2h上调6h下调的2种。通过比较circRNA对应的亲本基因在再生肝中10个时间点差异表达的显著性及查阅相关文献,最终筛选了与肝再生相关并且具有显著差异性表达的circ_1366,检测其对大鼠正常肝细胞株BRL-3A的增殖调节作用。首先通过基因干预方法检测circ_1366在大鼠正常肝细胞株BRL-3A中的相关表达水平,然后通过MTT法检测其对细胞活性的影响、流式细胞术检测其对细胞周期的进程影响、qRT-PCR与Western blot实验技术研究与肝细胞增殖相关的mRNA/蛋白的表达变化,分析circ_1366对大鼠BRL-3A细胞增殖的调控方式。结果表明转染circ_1366过表达质粒48h后,过表达实验组circ_1366的表达水平约是空载对照组的9倍;MTT法检测表明过表达实验组比空载对照组细胞活性明显增加;流式细胞术检测表明过表达组比空载组S+G2/M时间段的细胞个数所占比例并没有太大变化;qRT-PCR和蛋白质免疫印迹检测表明,circ_1366过表达后BRL-3A细胞中与肝细胞增殖相关基因CCND1、CCNA2、JUN、MYC、PCNA的mRNA和相应的蛋白水平均为上调,与凋亡相关的基因CASP3、CASP9的mRNA及相应的蛋白水平均为下调,其中CASP3比CASP9的表达情况下调的较显著。而通过circ_1366干涉片段处理细胞后,与阴性对照组相比,分析得到干涉效率约为73%;MTT法检测表明干涉组比对照组细胞的活性是明显降低的;流式细胞术检测显示干涉组比对照组S+G2/M时间段细胞个数所占比例很大程度的减少;qRT-PCR和蛋白质免疫印迹检测表明,circ_1366干涉后大鼠正常肝细胞株BRL-3A中与肝细胞增殖相关基因CCND1、CCNA2、JUN、MYC、PCNA的mRNA和相应的蛋白表达水平均下调,与凋亡相关的基因CASP3、CASP9的mRNA及相应的蛋白水平均为上调,显示circ_1366过表达可以促进大鼠BRL-3A的细胞增殖,而circ_1366的干涉能够抑制BRL-3A的细胞增殖。因此,circ_1366可通过影响与细胞增殖相关的基因/蛋白水平影响BRL-3A的细胞增殖途径。
【学位授予单位】:河南师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q952

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