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《武汉大学》 2010年
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反义GNOM诱导表达系统短时调控生长素分布对拟南芥胚胎发生和根发育的影响

郭荆哲  
【摘要】:植物的个体发育包括胚胎发生和胚后发育两个阶段:胚胎发生建立了植物个体的基本形态模式,而胚后发育则通过不断地器官发生和器官生长形成常见的成体植株。众多研究表明,由生长素极性运输建立的生长素的浓度梯度对于胚胎发生和胚后发育起着极其重要的调控作用。这些研究多数是利用突变体或者使用相关抑制剂破坏生长素的运输来开展工作的。然而这些突变体大多在胚胎发育时期就已经开始出现异常,我们观察到的表型大多是积累起来的缺陷或由此产生的间接效应,因此难以准确分辨出特定发育阶段或特定区域细胞对生长素动态的真实反应。而利用抑制剂处理的方式则往往导致生长素在较大尺度上的变化,得到的结果难以反映植物组织真实的自然应答规律。鉴于此,有必要采取更为精细的手段来开展相关研究。为了能在植物特定组织和其特定发育时期展开研究以便细致观察,同时尽可能避免表型变化的积累效应,我们选择合适的基因,采用诱导表达系统,通过操纵其表达来短时控制生长素动态,从而借以观察植物组织的反应形式、调节机制、以及特定细胞的分化与发育命运对生长素的依赖性和可塑性。 前人的研究表明在拟南芥的胚胎发生、主根发育以及侧根发生过程中,生长素的极性运输很大程度上是由生长素输出载体PIN家族蛋白执行的。研究还发现这些PIN蛋白会通过胞吞或胞吐作用在细胞质和细胞质膜之间循环,以此动态地调节生长素的输出方向和流速。GNOM基因就是参与调节这一循环过程的一员。它编码一个参与细胞内膜泡运输的ADP-核糖化因子-鸟苷酸交换因子(ARF-GEF, guanine nucleotide exchange factor of ADP-ribosylation factor)蛋白,参与循环内体到基部细胞质膜的膜泡运输以及向基部运输的类转胞吞作用,从而维持生长素输出载体PIN1(PIN-FORMED)蛋白在细胞质膜基部的极性分布。GNOM蛋白对生长素极性运输的调控以及由此对植株主根及侧根的生长与发生的调节具有明显的剂量效应。所以GNOM基因是一个检验生长素响应到细胞学效应的绝好调控点。因而,本研究以拟南芥为材料,以胚胎发生、主根的生长以及侧根的发生与发育为主要考察对象,利用诱导表达系统人为调节GNOM基因表达的方法来调控生长素动态,在时间和空间上小尺度地改变生长素的运输和积累,借以达到上述研究目的。主要研究结果如下: 1.建立了一个能够有效下调GNOM蛋白表达的反义GNOM诱导表达系统。我们将GNOM基因的第一个外显子片段反向插入糖皮质激素诱导表达启动子的下游,并通过遗传转化导入拟南芥,最终选取了表型最明显的InAGN9株系作为后续实验材料。InAGN9植株中的反义GNOM片段的mRNA表达量在地塞米松(DEX)诱导后的第二天就能提高到内源GNOM基因本底表达量的110倍左右,GNOM蛋白的表达量也出现明显下调。诱导的InAGN9的幼苗表现出与gnom突变体类似的表型。在撤销诱导后,反义片段的表达在1d后即检测不到。说明我们所建立的反义GNOM诱导表达系统能有效地下调GNOM蛋白的表达,并在撤销诱导剂后能够迅速停止反义片段的转录。因此我们建立的系统能有效地通过诱导和去除诱导实验短时下调GNOM蛋白表达,从而实现短时调节生长素的动态。2.以根的发育和发生为对象,考察了反义GNOM诱导表达系统对生长素动态的调节能力。诱导后的InAGN9幼苗主根伸长对生长素变敏感,生长素响应markerDR5-GUS的信号也额外地出现于侧根冠细胞中,而在根尖中柱组织内的信号却减弱了。在诱导10h后即可在部分InAGN9幼苗根尖中观察到这种生长素响应模式,表现为生长素的异常分布。而在第24h全部诱导的根尖都出现了该异常分布现象。去诱导后,异常的生长素响应分布模式开始逐渐恢复,最早能观察到的具有正常分布模式的根尖也是在去诱导后的10h,而在24h后全部根尖都恢复了正常的生长素响应模式。可见植物组织在生长素正常运输受到干扰情况下10h内可迅速做出反应。当干扰解除后亦可迅速在一天之内恢复常态。这种自我调节机制可能对确保植物细胞在应对干扰情况下保持正常分化、发育有重要作用。 进一步通过对几种生长素输出载体蛋白的表达和定位分析发现,PIN7蛋白的表达区域在诱导GNOM表达下调后扩大到了更靠主根基部的侧根冠细胞中,而它在细胞内的极性分布仍然保持正常,这可能是造成额外的生长素从静止中心和根冠中轴流入侧根冠细胞中,产生异常生长素分布的原因。在诱导GNOM蛋白表达下调后,我们没有观察到PIN1、PIN2和PIN3蛋白的表达区域以及细胞内的极性分布发生明显改变,然而PIN1和PIN7蛋白的表达在分生组织区的中柱组织中降低了,这很可能减弱了来源于茎端的生长素向根尖分生组织区的运输,而导致该处组织中DR5-GUS信号的减弱。这些结果暗示PIN1和PIN7蛋白在根尖生长素动态调节中有敏感而活跃的作用。 3.在胚胎发生过程中对生长素的极性运输进行短时干扰后,可以观察到胚胎的发育普遍出现滞后于对照的现象以及胚轴与子叶的膨大现象,少量胚胎还出现顶部和基部组织发育的异常以及细胞分裂的不同步。表明胚胎发生早期顶基模式建成对生长素极性运输的固有模式有明显的依赖性,且对其动态变化非常敏感。生长素的这种影响可同时表现在顶、基两极细胞的分化与定向生长方面。 4.短时影响根尖生长素的运输与积累后,主根根尖的伸长被迅速抑制;但是随着生长素的运输和积累恢复正常,根尖的伸长也随之恢复正常状态。研究揭示,在短时干扰过程中,分生区细胞分裂及后续分化正常,但是根尖细胞的伸长受到抑制,导致了主根的缩短,这种抑制可能是侧根冠内异常积累的生长素造成的。短时处理以后这种抑制效果并不持久,随着生长素的运输恢复正常,根尖细胞和主根的伸长均回复到对照水平。这一结果表明,在主根生长过程中短时调节生长素可迅速导致表型的变化,即植物形态建成的变化,但细胞发育命运没有改变,因而这种变化是可逆的。 5.侧根的发生过程中短时干扰生长素的运输和积累严重地抑制了侧根的出现,该抑制作用在去诱导后仍具有持久效应。对生长素运输进行干扰后,侧根原基的起始和发育均受到较为严重的抑制,这种抑制很可能是由于短时诱导期间根尖分生组织区内中柱组织的生长素积累水平下降造成的,因为在短时诱导的过程中外加生长素可有效地恢复侧根原基的起始与发育。在恢复生长素的正常运输后,侧根发生被抑制的部分也无法重新出现侧根。前人已揭示特定组织中生长素的分布模式对器官发生至关重要,我们的结果表明这种分布模式的适时性同样至关重要。错过细胞命运抉择的关键时刻,预定发育过程便无法再现。因而,器官发生与器官发育对生长素动态分布的依赖性有显著差异,暗示其反应和调节机制的不同。 6.进一步观察发现,侧根发生相比主根的发育对生长素动态的改变更加敏感。通过控制诱导时采用的DEX浓度,我们对生长素的运输和积累进行了不同剂量的改变,结果显示侧根发生在低浓度的DEX作用下即可被强烈抑制,而主根发育的抑制则需要更高的诱导强度,且呈现出渐进式的抑制。此外,短时干扰对侧根发生具有持久的抑制效应,而主根的发育则不然。这一结果进一步印证了在微小尺度下调控生长素动态变化,以便观察植物组织的反应模式和细胞分化发育命运有重要意义。 7.此外,在短时诱导实验中观察到的InAGN9植株表型与gnom突变体的表型并不一致。由于排除了突变体存在一定的积累效应这一因素,所以很可能前者的表型才更能反映植物对适时生长素动态变化的自然反应。 综上所述,我们采用反义GNOM诱导表达系统在小尺度上人为短时干扰生长素的动态。在此基础上,我们发现对生长素分布模式的改变对器官发生和发育有不同的影响;揭示了细胞对生长素的敏感性不是固定的,可随生长发育的动态变化而变化;印证了生长素分布模式参与决定细胞命运的瞬时效应和不可重复性。
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