设计、合成、表征分子探针用以研究2-酮戊二酸的信号作用和构效关系

【摘要】：三羧酸循环是生物体中主要的代谢途径之一,它不仅为生命活动提供了能量,而且还为许多生命物质的合成提供了前体。2-酮戊二酸(2-oxoglutaric acid, 2-OG,图1)作为三羧酸循环中的一个中间体,具有重要的地位：它不仅参与了碳的代谢,而且还参与了氮的代谢,因此2-OG成为连接碳/氮代谢的桥梁。近年来,随着对2-OG生理作用的深入研究,科学家们通过大量体外实验发现,在细菌和植物中,2-OG还可能作为信号分子,用来调节碳/氮代谢的平衡。最近,我们以非代谢的2-OG类似物DFPA(图1)为分子探针,以鱼腥藻为生物模型,通过与法国马赛地中海大学张承才教授合作,首次借助体内实验证实了这一猜测。同时借助另一个2-OG类似物2-MPA(图1),我们进一步证实了2-OG是以酮羰基形式,而非缩酮形式发挥了信号作用。 我们希望进一步寻找和研究2-OG的受体蛋白,深入探索2-OG信号分子作用及其传导途径。因此,我们拟采用亲和柱层析法以及光亲和标记法来分离、识别和标定2-OG受体蛋白。其中,光亲和标记法可以研究2-OG与其受体的结合位点和作用模式,而亲和柱层析法则可识别、分离和纯化与2-OG结合的生物大分子。然而,无论采用哪种方法,首要的任务是设计能应用于光亲和标记法以及亲和柱层析法的亲和探针。而探针的设计,需要我们对2-OG的构效关系有一个清楚的认识。因此,在本论文的第一部分工作中,我首先对2-OG的构效关系进行了研究和探讨,随后在本论文的第二部分工作中,对光亲和标记探针以及亲和层析柱配体的设计与合成进行了讨论。 为了研究2-OG的构效关系,我们设计、合成并表征了D、E、F和G四个系列的2-OG类似物(图2)。在这些类似物中,我们以亚甲烯基来代替了2-OG中C2位的酮羰基以阻止其在生物体中被代谢,并用不同的官能团或碳链,代替或修饰于2-OG的羧基、五元碳骨架及C3或C4位。在这些探针分子中,D系列类似物是为了考察2-OG的羧基对活性的影响,E系列是为了考察2-OG两个羧基之间碳骨架的长短对活性的影响,而F、G系列则是为了考察2-OG的C3和C4位结构与活性的关系,以便得到相应的C3和C4位结构与活性的信息。D系列E系列F系列G系列 我们借助文献报道或采用本论文中的路线成功地合成了图2中的大部分探针分子。D-2至D-4、E-2、DF-MPA是商业化的试剂或前期合成的化合物。对于F-1和F-2,由于其中间产物不稳定或合成路线不合适,我们没有得到其最终产物。 接下来,我们对这些探针分子的生物活性进行了测试和评估,并研究了2-OG的构效关系。所进行的测试包括：1)用细胞生物学手段和显微镜考察它们是否能够诱导鱼腥藻异型胞的分化；2)用高分辨魔角旋转核磁技术(HRMAS NMR)跟踪探针分子在体内吸收情况,以考察它们是否能够被鱼腥藻突变体KGTP菌株细胞膜中的2-OG通透酶所识别；3)用凝胶电泳迁移实验考察它们是否具有促进2-OG的受体蛋白NtcA与其靶标基因DNA结合的能力。 测试结果表明,DF-MPA和DMPA可以模拟2-OG的信号分子作用,诱导异型胞的分化。同时,DF-MPA和DMPA能够被2-OG通透酶识别,并被鱼腥藻突变体KGTP菌株有效地吸收,且能显著地促进NtcA蛋白与靶标基团的结合能力。此外,在剔除ntcA基因的突变体中,它们均不能诱导异型胞的分化。进一步的实验结果表明,部分无异型胞诱导活性的探针分子也能被2-OG通透酶识别,并进入体内。然而,它们均没有明显的促进NtcA蛋白与靶向基因结合的作用,因而不能模拟2-OG的信号分子作用。 依据所得到的生物测试结果,我们对2-OG的构效关系进行了分析,得到了以下结论：2-OG的羧基和五元碳骨架具是保持2-OG信号作用所必需的结构；2-OG的C2位的C=O能被=CH2或CF2模拟；在C4位上引进了C=C双键后,仍可保持其信号分子作用。 我们基于以上得到的2-OG构效关系,设计了光亲和标记探针H-1至H-6(图3)。H-1至H-3是用光敏基团替代了2-OG的C2位的C=O基团,而H-4至H-6是用亚甲烯基代替2-OG的C2位的C=O基团的同时,在C4位上引入了光亲和标记基团。我们仅合成了探针H-1和H-4,其它的亲和探针因其自身及光敏基团结构的不稳定性而没能得到最终产物。然而,遗憾的是,H-1和H-4都不具有明显促进NtcA蛋白与靶标基团结合的能力。 基于2-OG构效关系,我们随后又设计与合成了亲和配体H-7和H-8(图3)H-7和H-8是用亚甲烯基来代替了2-OG的C2位的C=O基团,并在C4位上引入了一个亚甲烯基,偶联于具有适当长度的末端带有胺基的亲和手臂。H-7是一个具有疏水手臂的亲和配体,而H-8是一个具有亲水手臂的亲和配体。我们成功地合成出这两个亲和配体并将其偶联至亲和柱的树脂上,以制备成亲和柱,用于识别和纯化2-OG的受体蛋白。 综上所述,在本论文中,我们设计、合成和表征了一系列代谢稳定的2-OG类似物,并以它们为分子探针,以鱼腥藻为生物模型,对2-OG的构效关系进行了研究,并以此设计了光亲和标记探针及亲和配体。我们完成了两个光敏探针的合成,两个亲和柱配体的合成并将其偶联至亲和柱树脂上制备了亲和柱。我们将进一步应用亲和层析法识别、纯化分离2-OG受体蛋白,以深入研究2-OG的信号作用及其传导途径。