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《武汉大学》 2011年
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还原裂解聚阳离子基因及化疗药物载体研究

彭娜  
【摘要】:层层自组装技术是一种将聚电解质、生物大分子、核酸类物质、和纳米粒子整合到基质,甚至三维支架表面的简单有效方法,能够对载入材料进行时间和空间上的调控。由层层自组装技术构建的含DNA多层膜用于原位基因转染中,通过控制聚阳离子的降解可以控制释放多层膜中的DNA,以促进基因转染。近年来,越来越多的研究聚焦于含双硫键的可还原降解聚阳离子。双硫键稳定,但在还原条件下可断裂降解。本文的第二章到第四章主要讲述含双硫键组装体在原位基因转染体系中的研究。 在第二章中,通过Michael加成,我们合成了一系列侧链接枝不同代数聚酰胺胺树形分子的聚双硫胺(G0-G3),通过聚合物中氨基质子化后带的正电性,分别与质粒DNA通过静电相互作用组装一系列含DNA的多层膜。多层膜中载入DNA的量和其厚度均随着聚阳离子侧链接枝代数的增加而减少。多层膜的体外释放结果表明,该系列多层膜释放DNA的速度与谷胱甘肽浓度和聚阳离子侧链接枝代数有关。随着谷胱甘肽浓度的增加,多层膜的降解速度增加;随着多层膜中聚阳离子侧链接枝代数的增加,其降解速度降低。MTT法测定结果表明该系列多层膜都具有较低的细胞毒性。293T细胞的原位转染实验结果显示,该系列多层膜的转染效率与谷胱甘肽浓度和聚阳离子侧链接枝代数之间没有明显规律性。总的来说,多层膜G2/DNA和G3/DNA在含有0mM、2.5mM和5mM谷胱甘肽的培养基中均能有效进行原位基因转染,多层膜G2/DNA在没有添加还原剂谷胱甘肽的情况下显示最好的基因转染效率。 在第三章和第四章中,我们将可还原降解的两亲性聚合物形成的阳离子胶束与DNA构建多层膜,并用于原位基因转染的研究。在第三章中,分别在胶束和DNA的水溶液和盐溶液中构建最外层为阳离子层或阴离子层的多层膜。实验结果表明,在水溶液中构建最外层为阴离子层的多层膜具有较低的细胞毒性和相对较高的转染效率。因此,在第四章中,我们选择在阳离子胶束和DNA的水溶液中构建最外层为阴离子的多层膜。以侧链接枝不同比例疏水链段的两亲性聚合物形成的阳离子胶束与DNA构建一系列多层膜,并研究侧链接枝不同比例疏水性链段对其构建多层膜的原位转染能力的影响。紫外检测结果表明,随着胶束中疏水链段十六烷基的增加,多层膜的增长速度加快,相应地载入DNA的量也更多。该系列多层膜的体外降解实验显示,多层膜在PBS7.4的缓冲溶液中稳定,但在还原条件下,多层膜可降解,并且降解速度随着多层膜中胶束所含疏水性链段接枝比例的增加而增加。MTT法测定结果显示,多层膜的细胞毒性随着多层膜中载入胶束所含疏水链段的增加而增加,但均低于参比多层膜PEI/DNA的细胞毒性。该系列多层膜均能有效实现原位基因转染,并且其转染能力随着多层膜中胶束所含疏水链段的增加而增加。 可还原降解聚合物作为药物载体是目前药物控释体系研究的热点之一。将酸敏感键引入聚合物中可以通过外界环境pH的变化来控制释放药物。 在第五章中,以侧链接枝两代聚酰胺胺树形分子的聚双硫胺为载体,通过酸敏感键(乌头酸酐,DAG2)和没有酸敏感的键(丁二酸酐,DSG2)接合抗癌药物阿霉素,并研究其对提高肿瘤细胞核内药物浓度及细胞毒性的影响。体外释药结果显示,阿霉素从聚合物DAG2中的释放呈现酸敏感响应,随着溶液pH的降低释放速度加快,而聚合物DSG2的释药行为没有明显的pH依赖性。MTT法测定结果显示,聚合物DAG2和DSG2对癌细胞HepG2和HeLa的毒性随着聚合物浓度的增加而增加,并且具有酸敏性的聚合物的细胞毒性明显高于同浓度下无酸敏性聚合物的细胞毒性。通过激光共聚焦显微镜观察细胞内阿霉素的含量和分布,发现细胞内荧光强度随着聚合物与细胞孵育时间的延长而增加,随着聚合物浓度的增加而增加,同浓度下,聚合物对HeLa细胞的毒性明显高于对HepG2细胞的毒性。无酸敏性聚合物与癌细胞作用后,荧光强度主要集中在细胞质中。具有酸敏性的聚合物在低浓度下与细胞孵育36 h后少量进核,但主要集中于细胞质中;高浓度下药物均匀分布于细胞核和细胞质中。 通过还原裂解模板法制备的多孔膜无需交联就能形成稳定的多孔结构。 在第六章中,通过还原裂解模板法制备多孔膜。以可还原裂解聚阳离子和不可降解聚阳离子作为混合聚阳离子,与聚阴离子通过层层自组装构建多层膜,然后在还原条件下降解其中的可还原降解的聚阳离子,从而得到具有孔洞结构的多层膜。通过该方法制备的多孔膜稳定,在pH1.6-10.0的范围内孔洞不可逆。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R943;TQ460.1

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【参考文献】
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