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《武汉大学》 2012年
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控释型白藜芦醇后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究

张翠  
【摘要】:背景: 心血管疾病中导致死亡的最主要病因是急性心肌梗死。目前公认的急性心肌梗死最有效的治疗方法是及时的恢复冠状动脉血流,使缺血导致心肌缺氧的状态尽快解除,从而减轻缺血带来的损伤。临床上心肌梗死的治疗手段取得了巨大的进步,如早期的溶栓治疗、冠状动脉搭桥术、经皮穿刺冠状动脉成形术等都能很快的恢复冠状动脉血流,从而挽救濒临坏死的心肌,缩小心肌梗死面积,改善患者的临床预后。然而,缺血心肌的早期再灌注引起了缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤。因此,在尽早恢复缺血心肌血供的基础上同时减轻再灌注损伤的发生已成为目前心肌梗死治疗的又一关键性问题。缺血预处理(ischemic preconditioning, IP)被认为是所知的最好的保护心肌缺血损伤策略。然而,在实际的临床工作中,由于无法预知心肌缺血发生的具体时间,这就限制了需在缺血事件发生之前实施的IP的临床应用。后来研究发现缺血后处理(ischemic postconditioning, IPO)也能减轻缺血心肌的再灌注损伤。而且,由于再灌注的起始是可控且可预知的,因此IPO的心血管保护作用具有临床可行性。但是由于IPO仅适用于行冠状动脉介入治疗的患者,且机械的IPO多次阻断血流可能会增加冠状动脉远端栓塞的风险。因此,寻求药物代替机械的IPO成为了I/R研究的新方向。 白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种主要存在于葡萄皮、中药虎杖、花生及藜芦等多种植物中的天然植物抗毒素,它具有多种生化和生理性作用,如抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、舒张血管、抗凋亡等作用。很多研究显示Res通过预处理实现其心血管保护作用,然而Res是否可以通过后处理产生心血管保护作用,目前国内外研究报道很少。而且,由于Res难溶于水,口服吸收差,在体内代谢快,半衰期很短,特别在紫外线照射下反式Res易转变成生物活性较差的顺式Res。因此,游离形式Res的生物活性不能得到充分发挥。新的制药形式制得易溶于水、可持续释放的Res用于心血管方面的研究国内外尚未见相关报道。本研究采用生物医用高分子材料构建控释型Res探讨其后处理对大鼠心肌I/R损伤的作用,并进一步研究其潜在分子机制。 方法: 实验一:用(PEG-MEMA-co-Boc-Cyst-MAAm)-b-PEG两亲性嵌段共聚物构建控释型白藜芦醇(Res-PEG-P)并检测其体外释药特性。选取新生的1-3天SD大鼠乳鼠培养心肌细胞,通过体外缺氧/再复氧(anoxia/reoxygenation, A/R,即缺氧3h/复氧2h)模拟在体的心肌缺血/再灌注(I/R)模型。实验分正常control组、A/R组、A/R+Res组(复氧开始后5min给予Res)、A/R+Res-PEG-P组(复氧开始后5min给予Res-PEG-P)、A/R+PEG-P组(复氧开始后5min给予PEG-P)。复氧结束时,为了评估心肌细胞的损伤程度,通过CCK-8法测定心肌细胞的存活率和比色法检测心肌细胞损伤时释放到培养液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)浓度;复氧结束后心肌细胞再培养24h,然后分别采用双标的流式细胞术和比色法测定心肌细胞的凋亡及caspase-3活性;采用real-time RT-PCR方法测定心肌细胞Toll样受体4(Toll like receptor4, TLR4) mRNA的表达,采用Western blot方法测定心肌细胞TLR4(细胞膜)、I-KBa(细胞浆)、NF-KBp65(细胞核)的蛋白表达,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)'心肌细胞培养液中炎性因子TNF-a与IL-1β的浓度。 实验二:选取230-260g的雄性SD大鼠为实验对象,建立心肌缺血/再灌注(I/R)模型(缺血30min后再灌注24h)。将50只造模成功的大鼠随机分为Sham组、I/R组I/R+Res组(再灌注开始后5min给予Res)、I/R+Res-PEG-P组(再灌注开始后5min给予Res-PEG-P)、I/R+PEG-P组(再灌注开始后5min给予PEG-P),每组10只。再灌注2h后采血,用比色法测定受损心肌释放到血清中LDH水平。再灌注24h后,采用Evans blue/TTC双染法测定心肌相对梗死面积,取心肌梗死组织进行TUNEL染色观察心肌细胞凋亡,用比色法测定caspase-3的活性,real-time RT-PCR方法测定心肌细胞TLR4mRNA的表达,Western blot方法测定心肌细胞TLR4(细胞膜)、I-KBα(细胞浆)和NF-κBp65(细胞核)的蛋白表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)血清中TNF-α及IL-1β的浓度。 结果: 实验一:与正常control组相比,体外A/R使A/R组心肌细胞存活率明显下降、LDH及caspase-3活性增高、心肌细胞凋亡显著增加、TLR4和NF--cB的表达显著上升、I-KBα的表达显著下降以及细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β的浓度明显升高。与A/R组相比,A/R+Res组和A/R+Res-PEG-P组心肌细胞存活率明显提高、LDH及caspase-3活性明显降低、心肌细胞凋亡显著减少、TLR4和NF-KB的表达显著下降、I-KBα的表达显著上升及TNF-α、IL-1β的浓度明显下降;而且,A/R+Res-PEG-P组的上述指标变化均比A/R+Res组大。A/R+PEG-P组与A/R组相比上述指标变化无明显差异。 实验二:与Sham组相比,在体I/R使I/R组血清中LDH活性显著增强、心肌相对梗死面积及TUNEL染色的凋亡指数明显增加、caspase-3活性显著升高、TLR4和NF-KB的表达显著增加、I-KBα的表达显著下降以及血清中炎症因子TNF-α、IL-1β的浓度明显上升。与I/R组相比,I/R+Res组和I/R+Res-PEG-P组血清中LDH活性明显下降、心肌相对梗死面积及TUNEL染色的凋亡指数明显减少、caspase-3活性显著降低、TLR4和NF-KB的表达显著下降、I-KBα的表达显著上升及TNF-a、IL-1β的浓度明显下降。而且,I/R+Res-PEG-P组的上述指标变化均比I/R+Res组大。I/R+PEG-P组与I/R组相比上述指标变化无明显差异。 结论: 1.体外培养的心肌细胞A/R时,控释型白藜芦醇后处理可改善心肌细胞的活力,减少心肌细胞的凋亡及炎症反应,并且控释型白藜芦醇的作用强于游离形式白藜芦醇,其机制可能与TLR4/NF-KB通路有关。 2.在体心肌I/R时,控释型白藜芦醇后处理可减轻心肌细胞的破坏,缩小心肌相对梗死面积,抑制心肌细胞凋亡及减轻炎症反应的发生,并且控释型白藜芦醇的作用强于游离形式白藜芦醇,其机制可能与TLR4/NF-KB通路有关。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R285.5

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