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《武汉大学》 2013年
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SARS冠状病毒非结构蛋白nsp14的结构功能关系研究

陶佳莉  
【摘要】:N7-鸟甘甲基化的帽子(cap)是真核生物mRNA的结构特征。大多数在细胞质中复制的真核细胞的病毒,包括冠状病毒,已经进化为对自身RNA进行加帽修饰。在以前的研究中,我们通过一个酵母遗传系统,来筛选严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)冠状病毒编码的形成帽子的酶,发现冠状病毒SARS的非结构蛋白nsp14,在酵母细胞内和通过纯化的酶和RNA底物的体外环境中,行使N7鸟甘甲基转移酶(N7-MTase)的功能。冠状病毒的nsp14曾被证明具有3’-5’的核酸外切酶活性。通过序列比对后,发现nsp14在结构上具有细胞N7-MTase保守特征。经突变分析,我们发现N7-甲基转移酶活性位于nsp14的C端部分上。对于N7-甲基转移酶活性而言,核酸外切酶活性位点不是必需的,但是需要核酸外切酶的结构域。这两个功能域的组合共同位于冠状病毒nsp14上,说明它可能代表一种新型的RNA加工酶。 冠状病毒编码N7甲基酶和2’-O-甲基酶(2'-O-MTase),其基因组RNA和亚基因组RNA的5’端在病毒两种甲基转移酶的连续作用下,形成I型帽子结构的。冠状病毒的N7-MTase很特别,它与核酸外切酶(ExoN)共同位于冠状病毒的非结构蛋白nsp14。在本研究中,通过对SARS冠状病毒的nsp14进行缺失和点突变,研究N7-MTase的结构与功能的关系。结果表明,冠状病毒的N7-MTase不同于其他病毒,即其他病毒的N7-甲基转移酶与在同一个多肽上的其他功能结构域是分开的,冠状病毒的核酸外切酶的功能域则密切参与行使N7-甲基转移酶的功能。通过酵母菌遗传系统和体外生化实验一共鉴定出对N7-MTase至关重要的12个关键氨基酸残基,其中两个位于N端核糖核酸外切酶中心区域的残基,对具有N7-甲基转移酶酶功能是必须的,更说明了ExoN区域在N7-甲基转移酶活性的重要作用。其他10个重要氨基酸分布在整个nsp14的N7-甲基转移酶区域,不过大多位于nsp14的甲基化酶的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的结合位点和甲基化酶蛋白结构折叠的的重要区域上。分析结果显示,nsp14基序DxGxPxA(氨基酸[aa]331~338)被认为是SAM的结合位点的中心位置。这些结果揭示了冠状病毒nspl4的N7-甲基转移酶的复杂的结构和功能的关系。 复制系统的突变分析显示,N7-甲基转移酶的活性对SARS病毒的复制转录很重要,因此该病毒蛋白可望作为抗SARS冠状病毒治疗的的一个药物靶点。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R373

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