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《武汉大学》 2013年
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克氏原螯虾C-型凝集素PcLT抗对虾白斑综合征病毒及抗弧菌作用机理研究

陈丹丹  
【摘要】:甲壳类动物缺乏像脊椎动物那样强大的适应性免疫系统(acquired immunity),其主要依靠先天性免疫(innate immunity)来抵御病原微生物的入侵。先天性免疫主要包括细胞免疫(cellular immune)和体液免疫(humoral immune)两大部分[1]。C-型凝集素作为一种重要的体液免疫因子,不仅能够参与病原相关分子模式的识别,还能够调节多种免疫反应。本研究以克氏原螯虾为实验对象,研究克氏原螯虾C-型凝集素PcLT基本结构、活性特征及抗溶藻弧菌(V. alginolyticus)、抗白斑综合征病毒(WSSV)作用,还通过与跨膜转导结构域融合表达以期获得一种对抗白斑综合症的口服蛋白亚单位疫苗。 本研究发现,肝胰腺特异性的PcLT,在受到溶藻弧菌及WSSV刺激后,其表达水平都会上调,并且在无血细胞的血淋巴中能够检测到PcLT蛋白,说明PcLT能够被分泌到血淋巴中参与抵抗弧菌及病毒。大肠杆菌系统中重组表达的rPcLT融合蛋白在Ca~(2+)存在的条件下,能够凝集革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌,这种凝集活性能够被甘露糖所抑制,说明rPcLT可以特异性结合甘露糖。rPcLT不行使效应分子的活性,在有无Ca~(2+)情况下,均不能抑制和杀死革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。但rPcLT能够结合溶藻弧菌、沙门氏菌及WSSV的囊膜蛋白,且结合活性不依赖于Ca~(2+)。 研究发现rPcLT能够引起体液免疫因子peroxinectin mRNA水平的上调、酚氧化酶(PO)及超氧化物歧化酶(SOD)酶活的上升、细胞吞噬作用增强。由于虾在感染WSSV后其体内的PO,SOD酶活会受到抑制,进而引起对虾的死亡。因此,PcLT提高酶活对于其抵抗WSSV可能是非常重要的。PcLT并不能像调理素一样直接与血细胞表面受体相结合,细胞吞噬作用增强可能与细胞粘连因子peroxinectin mRNA水平的上调有关。 体内病原体攻击实验结果表明PcLT既可以帮助机体快速清除弧菌,又可以抵抗WSSV。结合PcLT受病原刺激后的表达模式分析及病原体的感染机制,推测PcLT参与抵抗弧菌以及WSSV的机制可能有所不同。白斑综合症目前被认为是由于虾体感染WSSV后引起机体免疫机能下降,进而感染多种病原菌而导致的一种综合病症。而PcLT对WSSV及水产养殖中常见的弧菌的攻击均能起到保护作用,这为研制对抗白斑综合症提供了一条新的途径。 近年研究发现,有一些小分子多肽可以介导外源物质穿过细胞膜进入细胞或者组织,即细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPP)。目前,研究最多的为人的免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转录激活因子的核心部分TAT穿膜肽及其突变体。本研究中为了实现PcLT蛋白质亚单位疫苗口服给药,将TAT穿膜肽的突变体PTD与PcLT及eGFP进行融合表达,并且通过荧光免疫组化发现PTD-PcLT-eGFP能够进入克氏原螯虾的中肠中。这为制备PTD介导的口服亚单位疫苗提供了可行性依据。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S945.4

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