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《武汉大学》 2013年
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荧光比色液滴微流控芯片检测核酸及蛋白质

向霞  
【摘要】:液滴微流控芯片是近年来在微流控芯片上蓬勃发展起来的一种操控微小体积液体的新技术,具有体积小、样品无扩散、避免样品间的交叉污染、反应条件稳定、试剂混合速度快、高通量分析、易于集成、操控及独立控制液体等特点。发展至今,液滴微流控芯片已广泛地应用于生物学、化学、医学、药学等多学科交叉领域,为自动化、微型化、简单化的分析提供了一种新的研究平台,对生化分析的发展起到了积极的推动作用。但是,如何进一步在液滴微流控芯片上进行低成本的、高通量的定量生化分析,仍然是扩展液滴微流控芯片应用范围面临的的重大挑战。本论文在此基础上,开展了液滴微流控芯片生化分析新方法的相关工作。主要内容包括以下四个方面: 1、基于液滴技术及钌配合物(Ru(bpy)2dppx2+, Ru)对量子点(QDs)的猝灭作用建立了一种荧光比色液滴微流控芯片检测双链DNA的新方法。实验中Ru同时作为QDs的猝灭剂和双链DNA的报告分子。当没有双链DNA存在时,静电作用使液滴内Ru与QDs相互靠近,QDs的荧光变弱,液滴呈暗绿色。当双链DNA存在时,由于Ru与双链DNA强的作用力致使猝灭过程中断,QDs的荧光恢复,Ru的荧光出现,导致液滴呈混合色。根据液滴的颜色变化实现双链DNA的检测。在优化条件下,液滴的荧光强度值与双链DNA的浓度之间具有良好的线性关系,在缓冲里和人血清里的检出限分别为1pg和0.9pg。该液滴传感平台具有高效、简单方便、检测快速等优点。 2、利用氧化石墨烯(GO)对单双链DNA具有不同吸附能力,在液滴微流控芯片上建立了一种同时检测两种特定序列核酸的新方法。在没有目标DNA存在时,不同荧光基团(罗丹明ROX和羧基化荧光素FAM)分别修饰的核酸探针在液滴里被GO猝灭,ROX与FAM的荧光都变弱,液滴呈现暗色。当目标DNA存在时,核酸探针与目标DNA杂交形成双链DNA,致使核酸探针远离GO表面,ROX及FAM的荧光恢复,液滴的颜色由暗色变为亮色。在该液滴传感器里,FAM和ROX的荧光强度分别与两种目标DNA的浓度具有良好的线性关系,DNA的检出限分别为9.46和9.67×10-8M。该方法通过将GO与液滴技术结合在一定程度上扩展了新的传感领域。 3、基于逐级试剂引入和液滴成像及液滴技术,在液滴微流控芯片上建立了一种检测多元化特定序列核酸的新方法。五种荧光基团(FAM)修饰的DNA探针在无交叉污染的条件下同时引入到同一个芯片通道里,依赖液滴操控技术调控DNA探针的液滴形成顺序,使其分别与目标DNA探针液滴及氧化石墨烯液滴融合反应。在没有目标DNA存在时,FAM修饰的DNA探针与GO之间发生荧光共振能量转移(FRET),FAM的荧光被猝灭,液滴呈现暗色。当目标DNA存在时,核酸探针与目标DNA杂交形成双链DNA阻断FRET的发生,FAM的荧光恢复,液滴呈现绿色。通过比较液滴的颜色及强度,实现定性及定量检测特定核酸序列。基于同样的实验原理,增加引入的DNA探针的数量,更多的DNA传感器能被建立。该方法不需要复杂的荧光标记和芯片设计,在发展高通量DNA分析方面具有很大的潜力。 4、基于钌配合物(Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2,(Ru))易与蛋白偶联及对QDs具有猝灭作用特点,建立了一种荧光比色液滴微流控芯片检测蛋白质的新方法。该方法以甲胎蛋白(AFP)为模型进行了验证。实验中,Ru偶联的AFP单克隆抗体(Ru-Ab)同时作为QDs的猝灭剂、AFP抗原的抓捕探针及比色的背景参照信号。在没有AFP存在时,QDs的荧光被Ru-Ab猝灭,液滴呈现红色。当AFP存在时,Ru-Ab与AFP之间强的特异性作用使Ru-Ab远离QDs的表面,QDs荧光恢复,液滴的颜色由红色变为绿色。该液滴传感器展示了好的灵敏度和选择性,液滴的荧光强度值与蛋白的浓度之间具有良好的线性关系,在缓冲溶液里和人血清里的检出限分别为0.06ng/mL和0.4ng/mL。该方法能用于临床样品中AFP的分析测定,在昂贵且稀少的样品分析中具有很大的应用前景。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q503;O657.3

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