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《武汉大学》 2013年
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基于磁场集成微流控芯片的禽流感病毒荧光检测

张瑞巧  
【摘要】:连续不断地传染性疾病的大流行(非典、禽流感、手足口病、登革热、甲型H1N1流感、H7N9流感等)给社会经济造成了巨大损失,给人类生命带来了极大威胁。因此,开发准确、简单、快速、便携,能够运用于疾病发生现场的病原体诊断方法和设备越来越多地引起人们的重视。目前常用的病原体检测方法有病原体分离培养技术、免疫酶技术(EIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光RT-PCR技术等。这些技术在临床诊断中已发挥了很大的作用。如病原体分离培养技术准确率高,敏感性和特异性好,仍是禽流感病毒鉴定的“金标准”,但其步骤繁琐,耗时较长,一般需1~2周才能得到检测结果,达不到快速诊断的要求,不利于现场采取紧急防治措施;ELISA具有较高的灵敏度,既可以检测抗体,又可以检测抗原,缺点是操作程序复杂,耗时费力,特异性相对较差,不同亚型毒株间易出现交叉反应,不能应对临床样品的复杂性;基于PCR技术的禽流感病毒检测方法选择性好、灵敏度高,但实验中存在假阳性问题,且依赖于专业的实验室仪器、设备和技术人员,不能满足疾病暴发时快速诊断的要求。 与传统的检测方法相比,微流控芯片有着试剂消耗少、反应速度快、分析效率高、操作简单、微型化、便携化、高通量等优点,能够满足病原体简单快速检测的需求。而磁珠是近几年发展起来的一种新型纳米材料,因其独特的性能,如表面含有各种活性官能团,具有大的比表面积,超顺磁性,容易被外磁场操控,生物相容性好等优点,而受到科研工作者的广泛关注。同时,利用量子点作为荧光标记材料可以提高检测的灵敏度,量子点也是一种新型的纳米材料,具有独特又优越的光学性能,如量子产率高,一元激发多元发射,耐光漂等性质。将磁珠分选富集及荧光量子点标记引入到微流控芯片中,能够将三者的优势整合到一起,发展一类基于磁场可控的微流控芯片的荧光检测方法,具有简单便携、快速低耗、高效灵敏等特点,有望实现在现场以及临床上对病原体进行简单快速检测。 鉴于此,本论文主要开展了以下三个方面的工作: 1.以禽流感病毒H9N2为研究对象,构建了一种基于微流控芯片的简单、快速、便携、实时的病原体磁免疫荧光检测方法,该方法以集成芯片作为反应容器,修饰有抗H9N2病毒表面蛋白HA的单克隆抗体的免疫磁球作为固相载体,链霉亲和素修饰的量子点(SA-QDs)作为荧光标记物,实现对病原体高灵敏的免疫荧光定量分析。该方法简单、快速、低耗、高灵敏,每个样品只需要2μL,检测限可达3.7×104copy/μL,整个分析仅需55min。同时,该方法还具有好的重现性和稳定性,其组内组间变异系数分别为2.87%和4.36%,并可用于复杂生物样品(组织或粪便)中病毒颗粒的高选择性检测,为病原体的现场快速检测提供了有力的工具。 2.在上述构建的基于微流控芯片的磁免疫荧光检测方法的基础上,进一步在微流控芯片上设计了不同的支路,每个支路固定修饰不同抗体的免疫磁珠,结合量子点荧光成像技术,实现了对不同亚型的禽流感病毒(H9N2、H1N1、H3N2)的同步免疫荧光检测。该方法的样品消耗量少(只需要2μL),检测限低(H1N110.98ng/mL, H3N213.76ng/mL, H9N29.35ng/mL),耗时短(整个分析仅需50min)。同时,该方法还具有好的重现性和稳定性,其组内变异系数依次为H1N13.56%, H3N24.44%, H9N23.92%,组间变异系数依次H1N15.78%, H3N26.84%, H9N25.51%;并可用于复杂生物样品(组织或粪便)中病毒颗粒的高选择性检测,为多种禽流感病毒的同步现场检测与不同亚型分析提供了一个良好的技术平台。 3.为了对病原体的检测方法做进一步的研究,在前期工作的基础上,又对上述三种禽流感病毒(H9N2、HIN1、H3N2)的核酸进行了同时检测。同样在微流控芯片上设计了不同的支路,每个支路固定修饰不同捕获探针DNA序列的磁球,结合量子点荧光成像技术,实现了对不同亚型的禽流感病毒(H9N2、HIN1、H3N2)的核酸的同步杂交检测。该方法的样品消耗量少,每个样品与试剂只需要3μL,检测限低,三种病毒核酸的检测限依次为H1N10.21nM、H3N20.16nM、H9N20.12nM,整个分析所需要的时间不到80min。同时,该方法还具有好的重现性和稳定性,其组内变异系数依次为H1N15.05%, H3N26.89%, H9N24.98%,组间变异系数依次为H1N16.53%, H3N27.18%, H9N28.88%。该方法为多种禽流感病毒核酸的同步检测与禽流感病毒的亚型分析提供了技术支持。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:O657.3

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