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《武汉大学》 2013年
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P53与细胞衰老、自噬和凋亡

雷岳山  
【摘要】:细胞自噬(autophagy or autophagocytosis):是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene, Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。并能在应激状态下被激活,以延长细胞寿命。衰老(senescence)是细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态,是正常成体细胞的必然归宿。细胞凋亡(apoptosis)是细胞应激条件下,由基因调控的主动且有序的自我消亡过程。应急激活细胞凋亡和细胞衰老的过程是癌症发展的两个主要障碍。 作为一种位于多种调控网络关键节点的蛋白p53,在通过控制细胞周期,维持细胞基因组完整性及各种细胞应激反应中具有至关重要的作用。p53通过控制增殖细胞由细胞周期G1向S移行的控制点参与细胞周期调控。它强迫具有DNA损伤的细胞停滞在G1期并进行DNA修复。如DNA不能被修复,则诱导其凋亡。 p53作为衰老、自噬和凋亡的共同调控蛋白,在细胞衰老过程中,p53究竟是抑制自噬还是促进自噬不甚清楚;同时p53可作为一种凋亡调控蛋白,对诱导细胞凋亡起重要作用,但其调控机理还不完善,尤其在与其他细胞凋亡调控因子共同存在下的作用机制还有待研究。本实验试图揭示p53在细胞衰老过程中对自噬的调控作用及可能机制;以及p53对肿瘤细胞凋亡的调控机制。为临床治疗相关疾病提供新的依据。 第一部分:p53与细胞衰老和自噬 目的:细胞衰老是细胞对多种应激的一种反应,主要表现为细胞周期的停滞;自噬被认为是细胞在应激状态下的一种生存机制。p53是衰老和自噬共同的调控蛋白,本实验在观察骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal stem cell; BMSC)衰老过程中细胞自噬改变的基础上,通过干扰p53明确p53对细胞衰老和自噬的作用。 方法:取全骨髓细胞贴壁分离、培养,获取大鼠BMSC,流式细胞术鉴定表面标志分子,体外诱导鉴定成脂肪和成骨能力;通过计算细胞倍增指数(number of cell doublings,NCD)、衰老相关SA-(?)-gal染色率等量化指标及透射电镜观察细胞衰老与衰老细胞线粒体形态变化;RT-qPCR及Western blot检测各目的基因蛋白的表达。 结果: 1、新鲜分离的BMSC培养并传至第2代(P2)时,细胞呈集落样贴壁生长、显示典型的成纤维细胞形态。流式细胞仪分析显示这些BMSC表面标志CD54和CD90的阳性率分别为91.6%±2.42和98.86%±0.02944;而造血系统细胞标志CD34和CD11的阳性率仅为0.05667%±0.03859和1.555%±0.095。这些细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能。以上特征符合公认的大鼠BMSC鉴定“金标准”。在P2的BMSC细胞增殖旺盛,仅存在极少数SA-β-gal染色阳性的细胞,随着细胞的传代培养,BMSC的增殖逐渐减慢,SA-β-gal染色阳性的BMSC逐渐增多,在培养至第6代时,细胞呈现宽大扁平状,SA-β-gal染色阳性率达到90%。在衰老过程中,衰老相关的蛋白P53的表达逐渐增高,其下游蛋白呈相同的趋势。 2、免疫荧光染色检测在衰老细胞中LC3A/B增高;透射电镜显示线粒体的肿胀变性,出现大量空泡状双层膜样自噬体;RT-qPCR发现自噬相关的蛋白Atg7和Atg12的mRNA在衰老过程中逐渐增高,Western blot检测发现衰老相关蛋白的表达与mRNA的水平基本一致。 3、通过慢病毒介导的shRNA可以有效的降低p53的mRNA和蛋白水平的表达,作为p53下游的细胞衰老调控蛋白p21也相应的表达下调。通过SA-β-gal染色检测发现干扰p53的表达能够一定程度上降低染色阳性细胞的比例。通过Western blot检测发现在干扰p53后衰老细胞的自噬相关基因的表达明显降低。 结论: 1.大鼠BMSC进入衰老状态时,同时也启动了自噬; 2.在细胞衰老过程中,p53不仅参与到细胞衰老的调控同时与细胞的自噬有关。 第二部分p53与细胞凋亡 目的:细胞凋亡或称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)是维持内环境稳定的重要机制之一,是由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡在癌症的发生和进程中起着至关重要的作用。目前尚未发现直接介导细胞凋亡的基因,但实验证实P53、RASSFIA被认为与细胞凋亡相关。p53不仅参与细胞的自噬的调控,而且p53也被确认是细胞凋亡的一种调控蛋白,本试验的目的是在观察SiHa细胞的细胞凋亡基础上探讨p53的细胞凋亡调控机制。 方法:构建RASSF1A全长表达质粒pcDNA-RASSF1A、pcDNA-p53和RASSF1A-RNAi干涉载体分别或共同转染培养的SiHa细胞,流式细胞术鉴定细胞转染率及细胞凋亡,RT-qPCR及Westernblot检测各目的基因蛋白的表达。末端标记法标记探针WT和Mut、EMSA/Gel shift检测p53与RASSF1A DNA的结合能力。 结果: 本研究转染RASSF1A、p53及RASSF1A-siRNA入SiHa, Western blot分析示RASSF1A或p53单转染能有效地提高各自的蛋白表达水平,而RASSF1A-siRNA却抑制IASSF1A蛋白表达水平。流式细胞术结合膜联蛋白V/PI染色显示,未转染对照组凋亡率为3.699±0.63%;pcDNA转染对照组凋亡率为9.965±2.896%;而在单转染RASSF1A或p53组,凋亡率分别上升至18.95±6.693%和32.932±6.173%。提示p53或RASSF1A均能诱导SiHa细胞凋亡。为进一步证实RASSF1A的效应,本研究采用siRNA进行了阻断实验。RASSF1A-siRNA转染SiHa细胞可显著地阻断内源性RASSF1A的表达。与pcDNA转染对照组比较,RASSF1A-siRNA转染导致SiHa细胞凋亡率下降至4.566±0.721%。 p53和RASSF1A超表达质粒转染共转染可使两者的蛋白表达水平同时提高。流式细胞术结合膜联蛋白V/PI染色显示:虽然p53或RASSF1A超表达均能加重SiHa细胞凋亡,但两者共同超表达并无协同作用(p53和RASSF1A共转染的促凋亡效应与p53单独转染时相似)。 通过EMSA/Gel shift检测显示加入p53抗体到结合反应内可形成一个超转移带(抗体/p53/RASSF1A)。而单链探针和一个突变体RASSF1A探针减弱了p53/RASSF1A复合物的形成。同时,用0-2.5μgp53检测其抑制效果显示明显的剂量依赖性 结论: 1. p53、RASSF1A均参与SiHa细胞凋亡,但两者无协同作用。 2.p53可与RASSF1A启动子特异性结合,p53很可能通过RASSF1A的这种牵制作用控制细胞凋亡的幅度,防止过度凋亡加重对组织的损害,使机体在应对恶劣环境刺激时,细胞的生存和死亡之间重新建立一种适宜的平衡。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R329.2

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