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《武汉大学》 2014年
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基于免疫磁分离和酶催化放大的禽流感病毒快速检测方法

周川华  
【摘要】:病毒性传染病如非典型性肺炎、禽流感、艾滋病等严重威胁到人们的健康。病毒的快速高灵敏检测对于科学应对病毒性传染病、有效地控制病毒的扩散和传播等方面有着重要的意义。然而,目前病毒检测的方法:如病毒的分离和鉴定、血清学检测方法以及酶联免疫吸附法(ELISA)操作繁琐、费时、灵敏度低;聚合酶链式反应(PCR)灵敏度较高,但是该方法需要昂贵的试剂、专门的操作人员以及专业的仪器,不适用于病毒的现场检测。 电化学免疫分析方法是一种新型的免疫分析法,它将免疫反应的高选择性与电化学检测的高灵敏性相结合,具有高灵敏度、低成本、低能耗、易于微型化等优点,因此受到了科研工作者的广泛关注。纳米材料由于其在光、电、磁等方面的独特性能,可以大大提高生物传感器的性能。其中,磁性纳米颗(MBs)由于其大的比表面积、快速的反应动力学以及好的分离富集能力而被广泛地应用于免疫分析中。采用磁球作为免疫反应的载体不仅可以简化预处理过程,减少免疫反应时间,同时还可以放大检测信号。因此免疫磁分离在细胞分离、病原体检测等方面得到了越来越广泛的应用。本工作将免疫磁分离和酶催化放大相结合,发展了几种适用于现场的病毒快速检测方法,主要包括以下几部分工作: (1)我们将高效免疫磁分离、酶催化放大和生物素-链霉亲和素系统相结合,构建了一种基于磁球的电化学免疫传感器,并将其应用于H9N2禽流感病毒的快速、高灵敏检测。我们制作了一种可以重复使用的磁性电极,并将其应用于基于磁球的电化学检测中。免疫反应以后,可以方便地将免疫磁性复合物捕获到磁性电极表面获得辣根过氧化物酶的电化学信号。而且通过简单的冲洗可以使电极的表面状态恢复,从而实现在同一个电极上进行多个样品的检测。与采用相同的免疫夹心结构直接在金电极上构建的电化学免疫传感器相比,基于磁球的电化学免疫传感器具有更好的分析性能。该方法可以在鸡粪样品中检测到10pg/mL的H9N2禽流感病毒。该方法具有简单、快速、高灵敏、特异性强等特点,在疾病的早期诊断中具有广阔的应用前景。 (2)将免疫磁分离和双酶放大相结合,建立了一种可以用于病毒颗粒高灵敏检测的电化学免疫传感器。我们通过将一种酶作为信号标记在免疫磁球表面形成磁性免疫复合物,然后将这种磁性免疫复合物捕获到利用第二种酶层层自组装修饰的磁性电极表面,利用这两种酶的耦合催化放大信号实现对禽流感病毒的高灵敏检测。本工作不仅提供了一个简单、快速、高灵敏、高选择性且适用于现场的病毒检测方法,还为发展高灵敏的磁性电化学免疫传感器提供了新的思路。 (3)将酶促金属化放大与基于磁球的电化学免疫分析相结合,建立了一种高灵敏的电化学免疫传感器,并将其应用于禽流感病毒的检测。该方法采用碱性磷酸酶作为信号标记通过免疫反应在磁球表面形成磁性免疫复合物。采用自制的纳米金修饰的磁性电极捕获磁性免疫复合物获得电化学信号。该方法通过碱性磷酸酯酶催化4-氨基苯磷酸钠盐(p-APP)水解生成对氨基苯酚(p-AP),而p-AP能够使银离子还原并沉积到磁性电极表面,最后通过电极表面银的溶出伏安信号进行定量检测。该方法结合了酶促金属化反应的特异性以及金属溶出伏安信号的高灵敏性等优势,可以巧妙地将酶催化产物通过银沉积的方式富集到磁性电极表面,显著地提高了免疫分析的灵敏度。进一步地,我们还构建了一种双电极信号转换系统,并将其应用于基于免疫磁分离和酶促金属化的电化学免疫传感器中。该策略可以有效地避免金属离子以及金属沉积对酶活性的影响,同时还能避免金属沉积到磁球表面,可以更好地实现对目标病毒的定量检测。 (4)我们首先建立了一种基于酶促金属化的比色分析方法,并将其应用于碱性磷酸酶的高灵敏检测,然后进一步将该方法与免疫磁分离相结合实现了禽流感病毒的高灵敏、可视化检测。基于酶促金属化的比色分析方法结合了酶催化反应的放大性以及金属纳米颗粒独特的光学性质,具有非常高的检测灵敏度。采用该方法可以实现在50μL样品中检测到0.6amol碱性磷酸酶,与基于金属纳米颗粒聚集的比色分析方法相比其检测限降低了4-6个数量级。此外,我们还将该策略成功地应用于免疫分析中,建立了一种不需要复杂仪器而且可以直接应用于复杂样品中病毒检测的可视化免疫分析方法。该方法的检测限低至17.5pg/mL。本工作不仅提供了一个简单、高灵敏的病毒检测方法,还为发展基于金属纳米颗粒的高灵敏比色分析方法提供了有效的信号放大策略。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.65;O657.1

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