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小RNA在线粒体中的功能研究

张晓荣  
【摘要】:线粒体存在于所有的真核生物细胞中,它为生命活动提供了能量。线粒体内膜上的电子传递链将二磷酸腺苷加上无机的磷酸催化成为三磷酸腺苷,也就是能量的化学形式。除了为机体提供能量外,线粒体还参与细胞的代谢、信号传导及细胞程序性死亡等过程。线粒体拥有自身的遗传系统,即和细菌类似的环状基因组DNA。线粒体DNA包含了蛋白编码基因、tRNA、核糖体RNA以及一些非编码RNA基因。线粒体有自身的转录和翻译体系,线粒体DNA的复制、转录以及线粒体mRNA翻译都是在线粒体内膜内进行的。线粒体DNA所编码的蛋白都是电子传递链的组成部分。 小的调控RNA主要包括小干扰RNA和miRNA,这两类小RNA从起初被发现开始一直被认为是对基因表达起负调控作用的,其中siRNA可以使靶基因的mRNA降解,而:niRNA会影响靶基因mRNA的翻译。在这两类小RNA调控基因表达的过程中,都要依赖一个RNA-蛋白复合体,也就是通常所说的基因沉默复合体(RISC)。在RISC发挥作用的过程中,其中的一个核心蛋白组分Argonaute2被认为既具有识别并结合RNA的结构域又具有切割mRNA的活性。Argonaute家族共有4个蛋白(Ago1-4),目前普遍认为4个AGO蛋白都会进入RISC复合体中发挥其功能。 关于RNA干扰的研究一直集中在细胞质和一些膜结构中,最近的一些研究工作发现,RISC复合体中的核心蛋白AG02在线粒体中存在,同时线粒体中也有miRNA被鉴定出来,但是它们在线粒体中的功能并不清楚。 我们在分析本实验室的Ago2CLIP Seq数据的过程中,发现Ago2结合了一些线粒体DNA编码的mRNA.同时,我们在已发表的Ago2CLIP工作中也发现了Ago2结合线粒体mRNA的现象。因为Ago2是基因沉默复合体中的核心催化组分,所以我们针对线粒体DNA编码的mRNA设计siRNA,发现siRNA可以下调线粒体基因的mRNA水平,并且减弱线粒体的功能。 本实验室基于RISC复合体的特性,即miRNA:mRNA的双链被Ago2等蛋白结合形成RNA-蛋白复合体,用免疫共沉淀的方法得到这个复合体。利用miRNA本身作为引物逆转录得到与之配对的靶基因mRNA对应的DNA序列,经过克隆测序,我们就可以得到体内miRNA所结合的靶标基因。通过这种方法,我们鉴定了肌肉细胞中特异表达的miR-1的靶标基因,在寻找到的miR-1的靶标中,不仅有细胞核编码的基因,还有一些线粒体DNA编码的基因。在后续的验证工作中,我们发现部分细胞核编码的靶标基因可以被miR-1负调控,但是线粒体基因的表达是被miR-1正调控的。 miRNA一般对基因表达起负调控作用,即miRNA可以抑制靶基因mRNA的翻译,或是影响靶基因mRNA的稳定性。最近也有研究工作报道在特定的细胞环境中miRNA可以上调基因的表达。而本工作中发现的miR-1上调线粒体基因的表达则完全与之不同。 我们发现miR-1的表达和线粒体基因的表达具有很强的相关性,二者在肌肉细胞分化过程中的表达量都会逐渐升高。我们还发现miR-1可以调节线粒体的功能,对线虫的miR-1进行基因敲除之后,发现在成体的线虫中线粒体的功能有所减弱。在小鼠的肌肉细胞中阻断miR-1的表达也会减弱肌肉线粒体的功能,并且在一定程度上会减缓细胞的分化。 我们发现小RNA机器存在于线粒体中,并且调节线粒体基因的表达。其中siRNA下调线粒体中靶基因的mRNA水平,与细胞质中的机制是类似的。但是跟细胞质中miRNA作用方式不同,miRNA在线粒体中上调基因的翻译水平。此外,小RNA在线粒体中参与的基因表达调控还可以影响线粒体的生物学功能,这在一定程度上影响了肌肉细胞分化的进程。


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