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《武汉大学》 2014年
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基于信号放大的核酸及蛋白质荧光分析新方法

刘宇飞  
【摘要】:核酸与蛋白质的高灵敏检测是生命分析化学研究的热门课题之一,它在临床医学、生物工程、司法鉴定和环境监测等方面具有重要意义。荧光分析法具有仪器设备简单、灵敏度高、选择性好等优点,是核酸及蛋白质检测的重要方法。但是,由于生物样品中特定核酸及蛋白质的含量低、干扰物质多,因此开发具有高灵敏度和高选择性的核酸和蛋白质检测技术显得尤为重要。信号放大技术是目前提高检测灵敏度的主要途径。本论文将纳米材料和信号放大技术与荧光分析法结合,在发展高灵敏核酸及蛋白质检测方面做了以下五个工作: 1、以埃博拉病毒核酸和人类免疫缺陷病毒核酸为检测对象,建立了一种高灵敏检测多组分核酸的方法。通过核酸聚合酶辅助的信号放大技术,结合氧化石墨烯可以猝灭有机荧光染料及对单、双链核酸吸附能力的不同,建立同时检测两种病毒核酸的新方法。当没有目标核酸时,Primer不能与分子信标结合而启动聚合反应,因而分子信标紧密吸附在氧化石墨烯表面,荧光信号被猝灭。当存在目标核酸时,目标核酸与其对应的分子信标杂交,改变了其原来的构象,核酸聚合酶启动聚合反应。在聚合的过程中,Primer逐步向前延伸,并与分子信标杂交成双链结构,从而脱离氧化石墨烯表面,荧光信号恢复。目标核酸则从杂交复合物中置换出来,并进入新的循环之中。通过恒波长同步荧光扫描,实现两种病毒核酸同时检测且不会相互干扰。 2、基于核酸适配子稳定性好和亲和力强的优点,建立一种信号放大检测蛋白质的新方法。设计两个分子信标H1和H2序列,并在5’末端标记荧光基团,其中H1含有凝血酶适配子序列,H2则与H1部分互补。当凝血酶与H1特异性结合后,凝血酶破坏了H1的茎-环结构,加速了H1与H2的杂交,所形成的H1-H2复合物又可与Blocker-DNA杂交,这样,通过凝血酶的诱导,H1、H2和Blocker-DNA杂交成双链结构,脱离氧化石墨烯表面,荧光基团的荧光不能被猝灭。与双分子信标相比,三条核酸链的组装增强了荧光检测信号,而氧化石墨烯的引入,既降低了检测背景,又无需在探针核酸上修饰猝灭基团,节约了检测成本。 3、氧化石墨烯虽具有较强的荧光猝灭效果,但由于其较强的非特异性吸附能力,因而在复杂样品检测中往往会出现假阳性信号。利用核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大技术,将氧化石墨烯与免疫分析结合,建立一种蛋白质检测新方法。方面提高了检测灵敏度,另一方面,利用氧化石墨烯对单链核酸与单核苷酸吸附能力的不同,降低了背景信号。在氧化石墨烯未经共价修饰的情况下,仍能在血清样品中检测目标蛋白质,且可以直接应用于其它蛋白质的检测当中。 4、量子点与核酸分子光开关可以作为双荧光信号应用于双链DNA的检测,但该体系无法用于特定序列核酸的检测。利用杂交链式反应将磁分离技术与量子点—光开关体系结合,目标DNA及捕获DNA将杂交链式反应产物固定于磁珠表面,核酸分子光开关因嵌入杂交链式反应产物而富集于磁珠表面,不能猝灭量子点的荧光。通过量子点荧光强度的变化就能定量检测目标DNA。这种方法拓展了量子点与核酸分子光开关在核酸检测方面的应用,实现了目标核酸的高选择性和高灵敏检测。由于利用了磁分离技术,在血清样品和缓冲体系中的检测结果几乎没有差别。 5、为进一步拓展量子点与核酸分子光开关在生物分析检测中的应用,在前一工作基础上引入链霉亲和素磁珠,一方面将免疫分析与杂交链式反应结合,另一方面链霉亲和素表面可以结合大量的生物素化DNA也能够起到信号放大的效果。本方法可以在血清样品中检测目标蛋白质。这种检测模型也可以应用于其它蛋白质的检测,具有良好的通用性。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:O657.3;O629

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