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《武汉大学》 2016年
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RNase P相关外导序列对HSV-1病毒的抑制作用及2012-2015年沙窝乡手足口流行病学调查

刘进  
【摘要】:单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1, HSV-1)隶属人类疱疹病毒科成员,通常引起龈口炎、角膜结膜炎、生殖器疱疹等疾病,在免疫缺陷人体中其潜伏感染的再激活会导致单纯疱疹脑炎、角膜盲等严重疾病。随着临床中耐药性毒株的出现,开发新型抗病毒复合物和新技术十分必要。RNase P是一种核酸蛋白复合物,它通过催化核酸位点的水解反应来剪切tRNA前体分子的前导链从而帮助tRNA成熟。研究表明RNase P通过tRNA前体的三级结构来识别tRNA前体。外导序列(EGS, external guide sequence)是一段能与靶标RNA序列结合共同形成类似tRNA前体三级结构并引导RNase P对靶标RNA序列特定位点进行剪切的RNA序列。近期研究发现,由tRNA前体衍生而来的EGS可以被用来抑制细菌和哺乳动物细胞内基因的表达。EGS进一步被发现可以有效抑制包括HIV、HCMV、HSKV、HBV在内的许多人类病毒基因的表达和病毒本身的复制。本研究设计并构建了数个针对HSV-1 ICP4基因mRNA的EGS。ICP4作为HSV-1病毒的一个立即早期基因,是病毒的主要转录激活子,对病毒的早期和晚期基因的表达以及病毒的复制必不可少。本研究通过提取的人源RNase P、ICP4 mRNA序列、EGS等成分构成的体外反应体系检测了不同EGS引导RNase P剪切ICP4 mRNA序列的效率,发现所构建的EGS其中一个(C468-A)在引导RNase P剪切ICP4 mRNA序列的效率上比从tRNA前体衍生而来的一个EGS (SER-A)要高60倍;之后,本研究通过用HSV-1感染表达不同EGS的HeLa及HOK (human primary oral keratinocyte)细胞系,通过Northern blot及Western blot方法分别检测ICP4 mRNA和蛋白质的表达水平,结果显示C468-A对ICP4 mRNA和蛋白质表达水平的抑制作用也更显著,感染HSV-1病毒以后,表达C468-A和SER-A的细胞系与亲代正常细胞系相比,ICP4基因表达水平分别有97%和75%的下降;同时,本研究也对HSV-1感染表达不同EGS的HeLa/HOK细胞系后病毒相关基因的表达量进行了检测,结果显示在表达C468-A或者SER-A的细胞中,TK、gC及ICP35等基因的表达均显著下降了75-97%;最后,我们测量了表达不同EGS的HeLa及HOK细胞感染HSV-1后病毒的生长曲线,结果显示感染18h以后表达C468-A和SER-A的细胞相对于正常的不表达任何EGS的细胞分别有7000倍和500倍的病毒滴度的降低。以上结果表明,本研究中所设计的EGS能特异性引导RNase P对ICP4 mRNA进行剪切从而在培养细胞中能够有效抑制HSV-1整体基因的表达及病毒的生长,因此具有改造成为抗HSV-1病毒药物的潜力。手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是世界范围内流行的儿童常见病,以发热、口腔溃疡、于、足等部位出现皮疹或疱疹为主要特征。少数重症患儿可出现脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等严重并发症,甚至导致死亡。引起于足口病的主要病毒为肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxasckie virus)A组4、5、7、9、10、16型、柯萨奇病毒B组2、5、13型、埃可病毒(Echovirus)和肠道病毒71型(EV71),其中以EV71及CA16(柯萨奇病毒16型)最为常见。中国疾病预防控制中心每年统计到的新生儿及儿童手足口的感染病例高达数百万,手足口病已经成为我国新生儿及儿童健康的严重威胁。本研究对2012、2013及2015年从湖北省鄂州市沙窝乡收取的总共358份手足口病患者咽拭子样品进行了实验分析并对当地环境及患者家庭分别进行了调查和采访。本研究对这358份样品用通用型肠道病毒试剂盒、EV71型肠道病毒试剂盒及CA16型肠道病毒试剂盒进行肠道病毒血清型检测,结果显示其中195份样品为肠道病毒阳性、51份样品为EV71阳性、66份为CA16阳性、18份为EV71及CA16共同阳性。之后,本研究分不同年份分别统计了这些样品的年龄分布、性别分布、时间分布、地区分布及临床症状分布特征。发现:肠道病毒阳性患者中女童感染EV71和CA16的比例大于男童;EV71及CA16在手足口疫情中交替流行;除了EV71和CA16以外其他肠道病毒可能在引起手足口病疫情中也发挥了重要作用。本研究分离得到一株CA16病毒株,通过基于病毒衣壳蛋白VPl部分核酸序列构建的进化树分析发现其与Zong等于深圳分离得到的两株B2b亚型病毒株最为相似,推测此病毒株属于B2b亚型。另外,本研究对51份肠道病毒阳性患者病例家庭日用水进行检测,结果显示其中45份为肠道病毒阳性,因此推测水源传播可能是手足口病传染的新途径。本研究总结了湖北省鄂州市沙窝乡2012-2015年手足口病的流行规律,对该地区流行手足口病毒的来源进行了合理推测,本研究对手足口病传染途径的新发现,为疫情的控制及防护提供了参考。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R373;R725.1

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