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《武汉大学》 2016年
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血小板HMGB1促进中性粒细胞募集参与脓毒症小鼠的宿主防御反应

周惠  
【摘要】:第一部分:血小板在盲肠结扎穿孔模型中发挥宿主防御功能目的:尽管血小板的经典角色是介导止血凝血的发生,越来越多的研究表明,血小板在炎症及免疫反应中扮演重要角色。尽管血小板在病毒及单一细菌感染引起的肺炎模型中发挥重要的宿主防御功能,然而血小板在多种微生物感染引起的脓毒症模型中是否参与宿主防御依然未得到证实。方法:选用野生型小鼠,经腹腔注射α -GpIbα抗体(血小板清除抗体)及对应的抗IgG对照抗体,并建立小鼠的盲肠结扎穿孔模型。注射抗体后2小时及盲肠结扎穿孔术后18小时收集小鼠血液,用血细胞计数仪器检测循环中的血小板计数。术后18小时,收集小鼠的腹腔灌洗液、血液及肺组织匀浆液用5%羊血培养基进行细菌培养,并将血液离心后检测其血浆中炎性细胞因子的水平。结果:注射抗α -GpIbα抗体可使循环中血小板水平显著下降。小鼠循环中血小板的平均水平是521×109/L,经腹腔注射1μg/g的抗α -GpIbα抗体两小时后,小鼠循环中血小板水平降低至14×109/L。在CLP术后18小时,我们再次采血检测循环中的血小板水平,在注射IgG同型对照抗体组(Isotype对照组)的小鼠,循环中血小板水平在500×109/L,而在注射了抗α -GpIb α抗体小鼠,循环中血小板的水平在在CLP术后18小时约为7×109/L。 血小板清除组小鼠的腹腔灌洗液、血液及肺组织匀浆液,倍比稀释后将其接种到培养皿137℃培养过夜。我们的结果表明,与Isotype对照组相比,血小板清除组小鼠的各个部位的细菌负荷显著升(p0.01)。与菌落负荷相对应的是,血小板清除组小鼠系统性炎症水平明显升高,其血浆中IL-6水平显著高于Isotype组(p0.01)。结论:腹腔注射抗α-GpIbα抗体(1μg/g)可使循环中血小板水平显著下降,虽然血小板水平显著下降。在小鼠的CLP模型中,血小板降低组小鼠的宿主防御功能受损,循环及器官中的细菌负荷显著升高,并表现出更高的系统性炎症水平。因此,血小板在脓毒症中发挥重要的宿主防御功能。第二部分血小板表面TLR4受体不参与脓毒症中的宿主防御,但可以减轻内毒素血症中的炎症水平目的:大量课题组已证实在人类及小鼠的血小板表面有Toll Like Receptor 4 (TLR4)的表达。TLR4是模式识别受体,能够识别病原相关分子模式(Pathogen Associate Molecule Pattern, PAMP),进而导致炎症基因的转录上调和固有免疫的触发。TLR4除了在免疫细胞表面表达外,在机体的实质细胞也有表达。不同细胞表面的TLR4具有各自不同的功能。血小板表面TLR4在脓毒症中的特异性功能尚未得到证实。方法:选用对照组小鼠,TLR4 KO小鼠,PF4 TLR4 KO小鼠(血小板表面TLR4敲除),并建立盲肠结扎穿孔模型及内毒素血症模型(LPS, 10mg/Kg腹腔注射)。内毒素血症后6小时及18小时收集小鼠血液,用血细胞计数仪器检测循环中的血小板计数,白细胞计数,并检测血浆中炎症细胞因子的水平。盲肠结扎穿孔术后18小时,收集小鼠的腹腔灌洗液、血液及肺组织匀浆液用5%羊血培养基进行细菌培养,并将血液离心后检测其血浆中炎性细胞因子的水平。结果:在内毒素血症模型中,PF4 TLR4 KO组小鼠循环中IL-6,IL-1β水平较其对照组小鼠显著下降,同样的趋势可见于血浆中IMGB1的水平。在LPS注射后6小时、18小时,PF4 TLR4 KO组小鼠循环中血小板计数及白细胞计数虽然也较正常状态下下降,但与TLR4 flox组小鼠相比,PF4 TLR4 KO组小鼠循环中血小板及白细胞计数下降的幅度显著减少。与此同时,我们检测了肺组织中MPO的水平来反应中性粒细胞的聚集水平,与循环中白细胞水平相对应的是,TLR4 flox组小鼠肺组织中中性粒细胞的浸润较PF4 TLR4 KO组小鼠较高。但盲肠结扎穿孔术后18小时,各组小鼠循环及脏器中的细菌负荷并无明显差异。相应的,各组小鼠的系统性炎症水平也无显著差异。NETs的形成在血小板上TLR4敲除后也未受到影响。结论:我们的结果表明PF4 TLR4 KO小鼠在内毒素血症模型中,系统性炎症水平明显较对照组组小鼠下降;而在盲肠结扎穿孔模型中,其菌清除水平并无改变,细菌负荷和对照组小鼠无显著差异。因此,我们的结果表明,血小板表面TLR4受体敲除可降低内毒素血症的炎症水平,但是并不影响机体的宿主防御功能和NETs的形成。第三部分脓毒症中血小板HMGB1通过促进中性粒细胞募集参与宿主防御反应目的:血小板可以释放大量的细胞因子和趋化因子,包括HMGB1。虽然没有细胞核,血小板依然在胞浆内有HMGB1的表达。尽管一直以来被认为是损伤相关分子模式(Damage Associated Molecule Patterns, DAMPs), HMGB1可被多种细胞表达,并在不同的细胞中扮演不同的角色。最近研究表明,血小板HMGB1基因敲除小鼠(HMGB1 PF4),在创伤及失血模型中显示出较轻的炎症反应和器官损伤。然而血小板HMGB1在脓毒症中细菌感染的反应尚未研究。在本研究中,我们通过血小板特异性HMGB1基因敲除的小鼠来研究脓毒症中血小板HMGB1的角色。方法:选用野生型小鼠,HMGB1 flox小鼠,HMGB1 PF4小鼠(血小板表面HMGB1敲除),并建立盲肠结扎穿孔模型,并检测各个种属小鼠术后的生存率。并于盲肠结扎穿孔术后18小时,收集小鼠的腹腔灌洗液、血液及肺组织匀浆液进行细菌培养,并将血液离心后检测其血浆中炎性细胞因子的水平。分离血小板,并用凝血酶刺激,用流式细胞仪检测血小板表面的P-selectin的表达;分离中性粒细胞,并与静息状态下及活化状态下的血小板共培养,检测中性粒细胞与血小板的结合,及活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)产生水平。结果:HMGB1 PF4小鼠脓毒症后七天死亡率较HMGB1 flox组明显升高。而HMGB1 PF4小鼠CLP术后腹腔灌洗液、血液、肺组织培养液中的菌落浓度远远高于HMGB1 flox小鼠。与细菌负荷趋势相一致,HMGB1 PF4小鼠炎症细胞因子的水平远远高于他们的对照组。HMGB1 PF4小鼠腹腔灌洗液中MPO的水平及中性粒细胞数目较HMGB1 flox小鼠明显降低。体外实验中发现,HMGB1 flox小鼠血小板在被活化刺激后,其表面P-selectin的表达明显增加,而]HMGB1 PF4小鼠的血小板表面P-selectin的表达较HMGB1 flox小鼠显著减少。HMGB1 KO血小板在激活状态下与中性粒细胞共培养后,其中性粒细胞ROS的产生水平明显下降。结论:HMGB1 PF4小鼠表现出更高的死亡率,在HMGB1敲除后,小鼠的细菌清除能力,宿主防御功能受损。且HMGB1 PF4小鼠腹腔中性粒细胞的募集显著下降。HMGB1敲除的血小板,其与中性粒细胞的结合能力及刺激中性粒细胞产生ROS能力显著下降。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R459.7

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