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《武汉大学》 2017年
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基于纳米基底芯片检测外周血中罕有细胞的研究

贺兆波  
【摘要】:人体外周血中存在着一些数量稀少但很特殊的罕有细胞,其在每毫升血液中数量仅有几颗至几百颗,却在临床和医学上具有非常重要的研究价值,例如循环肿瘤细胞CTCs,胎儿有核红细胞(Fetal NRBCs)以及病毒感染或者寄生的细胞等。这些罕有细胞可以直接或者间接反映出机体的健康状况,其中被称为“液体活检”的CTCs对于研究癌症转移以及诊断和治疗有着非常重要的意义,而胎儿NRBCs作为提供胎儿遗传信息可替代来源并用于无创产前诊断有着广泛的应用价值。然而,外周血中的罕有细胞由于数量稀少以及存在着大量背景干扰,使得如何从外周血中分离和检测这些细胞面临着巨大的挑战和机遇。受限于特异性不高以及细胞损失等因素,传统的细胞分离和检测手段不适用于罕有细胞的分析。近些年来快速发展起来的纳米材料以及微流控芯片技术为解决这些问题,实现对于罕有细胞的有效分离和分析提供了多种方案,能够明显地提高效率以及灵敏度。微流控芯片以其特有的快速分析少量样本以及并行样本处理能力,是作为转移、分离和分析罕有细胞的理想手段;另外,大量报道表明:具有良好生物兼容性的纳米材料基底芯片在罕有细胞的分离捕获和后续分析上面具有非常明显的优势。这是由于细胞所处微环境中的纳米结构化合物(包括细胞外基质蛋白、多糖和细胞表面的微绒毛等)能给予细胞结构和生物化学上的支撑;所以,由于这种增强的相互作用,纳米材料基底对于罕有细胞的分离研究具有广泛的应用前景。此外,生物纳米材料对于罕有细胞在细胞和分子水平上的体外鉴定和原位培养,以及体内长期示踪等具有重要用途。本论文将在纳米生物材料基底芯片对于罕有细胞的捕获效率高、生物兼容性好以及细胞原位鉴定分析等优点上,针对CTCs和胎儿NRBCs进行捕获和分析研究。主要的工作如下:1.羟基磷灰石/壳聚糖复合纳米颗粒基底捕获癌细胞的研究。通过在玻璃衬底上制备具有良好透光性和生物兼容性的羟基磷灰石/壳聚糖复合纳米颗粒薄膜形成3D的纳米结构芯片,研究了纳米结构基底增强与细胞表面化合物的相互作用提高捕获效果;并且通过化学修饰在芯片上结合抗体Anti-EpCAM用于捕获癌细胞;并且研究了对于人造血中目标细胞的捕获效果,以及纳米对于细胞活性的影响;另外,验证了对于临床全血样本中CTCs的捕获以及鉴定,以及用于后续CTCs研究的潜力。2.纳米结构基底芯片分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断。我们进行了使用HA/CTS NF基底修饰上新型高特异性的抗体Anti-CD147用于从全血样本中分离捕获和分析胎儿NRBCs的研究;研究了“双阳性”免疫荧光染色法(anti-ε-HbF、anti-CD71 和 DAPI)对于胎儿 NRBCs 的鉴定;对比了 Anti-CD147 和Anti-CD71对于胎儿NRBCs的捕获效果;接着研究了 FISH技术辅助验证母体外周血中捕获的目标细胞来源,以及初步研究了 10-30孕周中胎儿NRBCs的数目情况;另外,结合芯片上原位检测研究了胎儿NRBCs用于胎儿染色体畸形的诊断,验证了纳米结构材料分析胎儿NRBCs用于无创产前诊断的可能。3.生物素掺杂导电高分子纳米材料用于捕获和释放胎儿有核红细胞实现无创产前诊断。我们研究了在ITO玻璃上制备具备电刺激细胞可控释放的聚吡咯-生物素掺杂纳米薄膜,以及调控其表面粗糙度对于目标细胞捕获效果的影响;构建了以TF-1细胞系为模型用于模拟胎儿有核红细胞优化基底芯片对于目标细胞的捕获和释放;研究了低电压0.8V对于目标细胞的释放效果以及活性影响;研究了从临床外周血样本中捕获并释放回收胎儿NRBCs;另外,结合PCR、FISH以及全基因测序分析回收的胎儿NRBCs,进行了胎儿遗传的诊断;验证了使用anti-CD147包覆PBDNF芯片捕获并释放回收胎儿NRBCs进行检测实现胎儿无创产前诊断的策略是可行的。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R446.11;TB383.1

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