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《武汉大学》 2017年
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体外快速药物测定传感器研制及在治疗药物监测中的应用

彭安林  
【摘要】:世界卫生组织(WHO)统计资料显示,全球有30%的患者死于不合理用药。我国不合理用药情况更为严重,药源性不良反应的住院患者高达34%,其中抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和平喘药氨茶碱(AMI)引起的不良反应病例报道较为常见。患者因个体差异在治疗过程中对阿霉素和氨茶碱表现出的不同的量效关系。为了提高阿霉素和氨茶碱的疗效,避免或减少毒副反应的发生,临床用药指南提出:在患者治疗过程中应进行治疗药物监测(TDM),定期测定阿霉素和氨茶碱的血药浓度,在TDM的指导下针对不同患者调整用药剂量,设计出个体化给药方案,保证临床用药的安全性和有效性。目前常用于治疗药物监测(TDM)的方法有分光光度法,色谱法和免疫法。分光光度法灵敏度低,专属性差,易受干扰,在TDM中发展应用中有一定局限。色谱法仪器昂贵,对检测设备要求较高,样品预处理复杂,测定周期较长,无法实现临床批量快速检测。免疫法稳定性差,选择性低,且试剂盒昂贵无法普及使用,因而制约了其临床发展应用。因此开发新的检测设备,建立一种方便快捷的分析方法,使阿霉素及氨茶碱TDM工作成为常规临床检测项目辅助治疗,具有重要意义。电化学方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快捷等优点,在环境检测、生物分析、药物监测等领域受到的关注及应用日益增多。本研究将以电化学方法为基础,采用丝网印刷技术研制即抛型的传感器。相对常规检测仪器,即抛型电化学传感器易于制成便携式、低能耗设备;与传统柱状电极比较,它修饰简单,可批量制备,即用即抛;生物样品无需复杂前处理,检测方法简单易操作,极大提高了测定速度,使TDM有望进入常规性的临床检验,将提高临床用药水平,尤其针对安全范围狭窄、治疗血药浓度易波动的药物,TDM工作尤显重要。本论文以多壁碳纳米管(MWNTs),纳米金颗粒(nano--Au),多聚赖氨酸(PLL)为修饰材料,研制出了可快速测定阿霉素、氨茶碱的特异传感器,并成功用于生物样本和临床患者血药浓度的测定。论文的研究内容主要包括:第一部分:特异性阿霉素体外快速监测传感器的研制及在生物样品测定中的应用研究研制一种灵敏度高、选择性好的特异传感器,建立体外生物样品无需前处理的阿霉素快速检测方法,并进行生物样品、临床样品的实际测定,为实现合理用药,优化给药方案,提供新技术、新方法。第一节:多壁碳纳米管/多聚赖氨酸(MWNTs/PLL)修饰的阿霉素传感器的制备及其定量分析方法的建立采用丝网印刷技术制备丝印电极,制备工艺如下:首先于基质PVC片材上依次承印工作电极、辅助电极和参比电极得到裸电极(Bare SPE);通过循环伏安法(CV)、方波伏安法(SWV)等方法进行筛选,以确保印刷电极的稳定性和一致性;然后依次采用MWNTs和PLL对Bare SPE进行滴涂修饰得到MWNTs/PLL复合物修饰的DOX传感器。优化测定条件,于0.1mol/LHAc-NaAc(pH4.5)缓冲体系中采用方波伏安法(SWV)扫描测定DOX在MWNTs/PLL SPE上的电化学行为,建立全血中DOX的分析定量方法。在0.0025 μM-0.25 μM范围内,DOX浓度与峰电流呈现出良好的线性关系,相关系数为0.9954,最低检测限为1.0 nM。重现性考察中,日内、日间精密度RSD10%,加样回收率在92.60-106.87%之间。MWNTs/PPL修饰的DOX传感器灵敏度高,选择性好,生物样品无需复杂前处理,15min内即可完成分析测定,为临床治疗药物快速监测开辟了新方法。第二节:阿霉素定量分析方法确证及MWNTs/PLL传感器在实际生物样本阿霉素代谢监测中的应用利用MWNTs/PLLSPE建立的定量分析方法测定不同时间点小鼠体内DOX浓度,获得药-时代谢曲线,参照2015版《中国药典》应用高效液相法(HPLC)平行测定,对所建立的方法学进行确证。结果证实两种方法相关性良好,药-时曲线变化趋势一致,5min时血药浓度最高,此后逐渐降低。MWNTs/PLL SPE成功测定了不同时间点小鼠心脏中DOX浓度,与全血中含量存在一定相关性。DOX定量分析方法可行性高、实用性强,为TDM工作指引方向,临床上有望通过监测全血DOX浓度而推测组织中的药物浓度(尤其是心脏组织),优化给药方案实现最佳治疗效果。第二部分:特异性氨茶碱体外快速监测传感器的研制及在生物样品测定中的应用研究制备一种灵敏度高、特异性好的氨茶碱传感器,建立无需生物样品前处理的体外快速检测方法,并进行生物样品、临床样品的实际测定,为开发新的临床监测设备与技术,积累临床前研究数据。第一节:多壁碳纳米管/纳米二氧化硅/纳米金(MWNTs/Si02/Au)修饰的氨茶碱传感器的制备及其应用首先参照丝印技术印刷裸电极(Bare SPE),然后采用多壁碳纳米管,纳米二氧化硅,纳米金颗粒等材料对Bare SPE进行滴涂修饰得到MWNTs/Si02/Au复合物修饰的氨茶碱传感器。在最优条件下,应用方波伏安法在0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲体系中扫描测定AMI电化学特征。结果测得AMI在修饰电极表面于1.0V左右有显著的氧化峰,在5~200 μM浓度范围内与峰电流呈现较好的线性关系,最低检测限为0.5 μM。同一批制作的修饰电极的标准偏差(RSD)为4.17%,不同批次制作的修饰电极的标准偏差为6.26%,加样回收率范围在95.85-108.03%之间。建立了MWNTs/SiO2/AuSPE测定AMI的方法,在缓冲体系中灵敏度、重现性良好,可直接用于药物注射液及片剂含量的测定。由于AMI在MWNTs/SiO2/Au SPE表面是吸附控制的,在富集过程中,易受尿酸、蛋白质诸多杂质的干扰,传感器灵敏度及选择特异性降低,可检测的线性范围也减小,不能满足临床TDM。此外,在实际血样测定中,传感器MWNTs/SiO2/Au复合膜还存在脱片问题,稳定性还有待提高。鉴于以上原因,后续实验中将再尝试新的修饰剂和制备工艺,制备出可用于实际生物样本品测定的传感器。第二节:多壁碳纳米管/纳米金颗粒/多聚赖氨酸(MWNTs/Au/PLL)修饰氨茶碱传感器的制备及其定量分析方法的建立根据丝印技术印刷裸电极(Bare SPE),制备多壁碳纳米管/纳米金颗粒/多聚赖氨酸(MWNTs/Au/PLL)复合物修饰的AMI传感器。在最优条件下,应用SWV考察AMI在MWNTs/Au/PLL SPE表面的电化学行为。生物样品测定中,氨茶碱浓度在10~200 μM范围内与峰电流存在良好线性关系,最低检测限是2.0μM。电极批内、批间精密度RSD分别为3.34%和5.78%,全血中加样回收率范围是 96.68%-105.24%。成功研制了MWNTs/Au/PLL SPE,建立了生物样本(血样)中AMI的测定方法。与MWNTs/Si02/AuSPE相比,该传感器灵敏度高,重现性好,监测线性范围广,可用于实际生物样品的测定,为后续监测氨茶碱在动物体内的分布代谢奠定了基础。第三节:氨茶碱定量分析方法确证及MWNTs/Au/PLL传感器在动物体内氨茶碱代谢监测的应用试验1小鼠AMI灌胃给药后,以MWNTs/Au/PLL SPE定量分析方法为检测手段,测定AMI在小鼠体内代谢的药-时曲线及分布情况。同时参考2015版《中国药典》中AMI的测定标准,高效液相法(HPLC)进行确证分析。两种方法测定药-时曲线结果一致,90 min时AMI血药浓度达到峰值,半衰期约4-5 h。日内、日间精密度RSD15%,回收率在95%-110%之间,表明本研究中建立的定量分析方法是准确可行的。利用方波伏安法(SWV)测定了小鼠血液、肝脏、肾脏中AMI的代谢情况,成功建立了血样、肝脏、肾脏组织中AMI的工作曲线。试验2将64只昆明小鼠分为氨茶碱组和氨茶碱+罗红霉素组,均给予灌胃给药,分别于给药后 10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、240 min、480 min摘取眼球取血测定AMI浓度。两组小鼠AMI血药浓度范围呈抛物线式波动,初期血药浓度均稳定上升,90 min时达到峰值。但氨茶碱+罗红霉素组高于对照组半衰期也延长至330 min。在罗红霉素影响下,氨茶碱易在体内蓄积,血药浓度升高,代谢消除速度减慢。第三部分:特异性体外快速监测传感器在临床TDM中的应用研究将上述DOX及AMI定量分析方法用于临床患者血药浓度监测,进一步评估复合物修饰的即抛型传感器在临床TDM中的应用价值,同时为临床代谢工作者提供新方法。第一节阿霉素特异传感器在临床TDM中的应用A、B两组肿瘤患者静脉滴注不同剂量DOX化疗后(治疗剂量分别为50 mg/m2和 5 25mg/m2),分别于 0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 静脉采血,应用MWNTs/PLL传感器测定DOX含量。两组患者血样中DOX药-时曲线呈现快速消除相特点,给药1 h血药浓度从247±25.9 nM、174±28.3 nM迅速降低至94±16.6 nM、63±10.3nM。骨髓抑制、心脏毒性反应均与血药浓度正相关,A组患者血常规结果显示白细胞及血小板较治疗前减少,B组患者无明显变化;且A组心电图QT间期时间在给药2-4 h内较B组显著延长,部分患者不良反应达到了 1级心律失常,但心肌损伤标志cTnI及BNP在化疗前后无明显变化(P0.05),在DOX治疗早期对心肌毒性作用不显著。MWNTs/PLL阿霉素传感器可成功用于临床TDM,为患者和医生提供了新的检测方法,具有重要意义。第二节氨茶碱特异传感器在临床TDM中的应用A、B两组慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者分别静脉滴注0.25 g、0.5 g氨茶碱,连续给药3天并在第三天给药后0.5 h、1h、2 h、4 h、8 h、12 h采取静脉血。根据AMI定量分析方法MWNTs/Au/PLL SPE测定血药浓度;同时评估口服氨茶碱患者血药浓度,优化给药。两组患者血样中AMI药-时曲线呈现一级消除相特点,半衰期约为4h。毒副反应与给药剂量密切相关,B组AMI浓度高于A组,部分患者出现了胸闷、心率加速等轻微不良反应。在临床TDM监测中,患者因口服氨茶碱时间及剂量不当,出现了治疗效果不佳或中毒反应。调整给药时间及口服剂量后,上述问题得到解决。MWNTs/Au/PLL SPE成功测定了临床患者体内AMI代谢情况,优化了治疗方案,解决了治疗效果不佳及药物中毒问题,为体外传感器在TDM中的普及应用奠定了基础。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R96;TP212.3

【参考文献】
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