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《武汉大学》 2017年
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PNIPAAM修饰的介孔羟基磷灰石控释辛伐他汀对骨质疏松状态下骨缺损的成骨修复研究

吴涛  
【摘要】:骨质疏松症在临床主要表现为骨质脆性增大、易骨折,骨内微结构破坏、全身骨量形成减少。由于体内雌激素水平下降,成骨能力遭到破坏,该疾病在绝经后的女性表现得尤为明显。治疗骨质疏松症的给药途径主要分为全身用药和局部用药,药物又可分为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。尽管全身用药可以减少骨质疏松引起的骨折,但同时容易出现一些全身用药所致的副作用[1]。局部药物缓释治疗用于骨质疏松患者局部骨缺损的骨再生修复,既可解决骨缺损问题,又可解决局部给药问题。介孔羟基磷灰石(MHA)与骨组织中的羟基磷灰石(HA)有相似的大小和化学结构组成,其生物相容性良好、介孔结构排列有序,同时化学结构中富含OH-,可被化学修饰[2-4]。聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAM)是一种温敏性水凝胶。其最低临界溶解温度(LCST)为32℃,当温度32℃时,水分子和异丙基丙烯酰胺(NIPAM)基团的强氢键相互作用,凝胶吸水溶胀;当温度32℃时,氢键破坏,聚合物链从溶解状态转变为疏水状态,凝胶失水收缩。利用PNIPAAM这一特点,将其与MHA表面的OH-进行化学连接,再在MHA介孔内载药用于局部骨缺损区域缓释药物可达到治疗的目的[5]。综上,我们设计了以下三个实验来解决上述问题:(1)首先合成介孔羟基磷灰石(MHA)纳米材料,对其进行PNIPAAM化学修饰,再载入具有成骨作用、抑脂作用的辛伐他汀(SIM)药物,构建出MHA-SIM-PNIPAAM药物缓释体系。然后对该体系进行表面形态、内部结构、化学组成、晶格分析及药物释放等实验。(2)采用直接冲洗法提取出大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs),对其进行成骨、成脂、成软骨及细胞表面蛋白鉴定。再对第一部分合成的MHA-SIM-PNIPAAM药物缓释体系进行体外细胞毒性、及成骨矿化的基因水平研究。(3)采用卵巢摘除术构建骨质疏松动物模型。研究和比较骨质疏松大鼠和正常对照大鼠MHA-SIM-PNIPAAM药物缓释体系和单纯MHA在局部骨缺损的再生修复作用,包括细胞形态及粘附能力、成骨分化能力、新骨形成和矿化、骨再生过程中破骨细胞活动等。第一部分MHA-SIM-PNIPAAM的合成及其性质目的:合成PNIPAAM修饰介孔羟基磷灰石(MHA)控释辛伐他汀(SIM)的载药体系并检测该体系的物理、化学特征。材料和方法:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为表面活性剂,采用微乳液法制备介孔羟基磷灰石(MHA)。通过表面引发原子转移自由基聚合(SI-ATRP)在MHA表面修饰了 PNIPAAM聚合物刷。扫描电镜(SEM)检测材料表面形态,投射电镜(TEM)观察材料内部形态。X射线衍射(XRD)和BET测试检测材料内部孔隙和晶格分布。傅立叶红外光谱分析(FT-IR)和X射线光电子能谱分析(XPS)确认MHA-SIM-PNIPAAM纳米颗粒的化学组份。紫外分光光度计检测材料控制SIM缓慢释放的情况。结果:扫描电镜和投射电镜显示MHA-PNIPAAM纳米颗粒呈长40~50nm,宽15~20nm短棒状分布,内部可见约4~5nm的介孔,表面有约5nm左右的多聚物覆盖。XRD和BET测试同样证实MHA材料内部介孔的存在。XPS和FT-IR分析显示MHA组成元素有Ca、O、P;MHA-PNIPAAM组成元素有Ca、O、P、N。缓释实验显示PNIPAAM修饰后的MHA载入SIM药物后可持续缓慢释放药物达16天。结论:MHA-SIM-PNIPAAM纳米颗粒成功合成,药物SIM持续缓慢释放可达16天。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养、鉴定及MHA-SIM-PNIPAAM的生物学性能目的:分离并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测MHA-SIM-PNIPAAM纳米颗粒的生物学性能。材料与方法:直接培养法提取wistar大鼠BMSCs,分别进行茜素红染色、油红染色对细胞进行成骨向分化、成脂向分化鉴定。采用细胞团块培养法行成软骨向诱导后,对细胞团块行常规组织切片,阿尔辛蓝染色进行成软骨向分化鉴定。流式细胞检测BMSCs细胞表面CD90、CD45蛋白的表达。CCK-8法检测MHA、MHA-PNIPAAM及MHA-SIM-PNIPAAM纳米颗粒浸提液中BMSCs的增殖情况。细胞荧光染色检测BMSCs在MHA、MHA-PINPAAM纳米材料上细胞形态及粘附。荧光定量PCR检测MHA、MHA-SIM-PNIPAAM材料浸提液对成骨基因RUNX2、OCN的表达。结果:直接法提取的wistar大鼠BMSCs具有成骨、成脂、成软骨三向分化的能力。细胞流式检测BMSCs表面CD90表达99%,CD45表达10%。CCK-8细胞增殖实验表明MHA、MHA-PNIPAAM及MHA-SIM-PNIPAAM纳米颗粒对BMSCs均无细胞毒性。BMSCs在MHA-PINPAAM纳米材料平板上孵育8小时后伸展更好,贴壁细胞数量更多。诱导7天后,MHA和MHA-SIM-PNIPAAM组对正常BMSCs的RUNX2基因表达有所增强,但是在诱导14天后,只有MHA-SIM-PNIPAAM组较空白对照组对RUNX2基因有增强。MHA和MHA-SIM-PNIPAAM两种纳米颗粒对于OCN基因表达均呈增强作用。结论:成功提取wistar大鼠骨髓间充质干细胞,MHA-SIM-PNIPAAM纳米颗粒具有良好的生物相容性,且能促进成骨基因的表达。第三部分骨质疏松大鼠模型的建立及MHA-SIM-PNIPAAM纳米材料用于骨质疏松状态下成骨性修复的体内及体外研究目的:评估MHA-SIM-PNIPAAM缓释体系对骨质疏松状态下大鼠成骨性修复的体外及体内研究材料和方法:采用卵巢切除术后再饲养2个月,建立大鼠骨质疏松模型。细胞荧光染色观察骨质疏松模型(OVX)与正常对照(Sham)的BMSCs细胞形态差异。茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)活性定量分析MHA和MHA-SIM-PNIPAAM纳米材料在骨质疏松模型与正常对照BMSCs的成骨活性水平。μCT定量分析MHA和MHA-SIM-PNIPAAM纳米材料修复大鼠股骨头骨缺损的骨体积分数(BV/TV),骨小梁数目(Tb.N),和骨小梁间隙(Tb.Sp)的差异。HE染色、免疫组化观察MHA和MHA-SIM-PNIPAAM纳米材料修复大鼠股骨头骨缺损的新骨生成情况。TRAP染色观察缺损区破骨细胞分布。结果:μCT确认wistar大鼠骨质疏松模型建模成功。与正常对照的BMSCs相比,骨质疏松的BMSCs细胞形态更扁平、触角变短;成骨向分化的能力减弱。MHA-SIM-PNIPAAM纳米材料缓慢释放的SIM促进了 BMSCs的成骨分化。μCT和HE染色显示术后3周同组之间差别较术后6周大;术后6周时,MHA-SIM-PNIPAAM组愈合情况最佳。免疫组化显示OPN蛋白在骨缺损区的表达总体较BSP蛋白表达强,在MHA-SIM-PNIPAAM组均表达最强。OPN蛋白主要分布于新形成骨周围及材料周边。术后3周BSP蛋白术的表达较术后6周的蛋白表达强。TRAP染色示骨质疏松模型的骨缺损区,MHA-SIM-PNIPAAM组的破骨细胞数量最少。结论:MHA-SIM-PNIPAAM纳米材料在骨质疏松的大鼠股骨缺损区有较好的成骨效果。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R580;R318.08

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