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《武汉大学》 2017年
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模拟缺氧对不同材料表面上前体成骨细胞生物学行为影响的研究

李水根  
【摘要】:随着当前口腔医学水平的不断发展,种植修复已逐渐成为牙列缺失(损)修复的较好方法,其具备了固位稳定性好、异物感弱、咀嚼功能完善等优点[1-3]。目前,凭借着良好的生物学相容性以及机械性能,钛以及钛基合金被广泛应用于临床中,然而,钛基合金本身结构、性质与天然骨组织仍然存在着较大的差异性[4-6],因此无法具备完善的骨诱导性,促使针对钛基种植体材料功能性修饰研究成为一大热点[7-10]。组织工程学中,各类生物材料与细胞之间具有十分紧密的联系[11],细胞通过自身的一系列生物信号去发现、感知材料的表(界)面,从而达到粘附、铺展进而增殖;研究发现材料界面的粗糙度能够影响细胞的生理,特别是具有微纳米级别的表面结构,能够在某些程度上促进细胞的生物学行为,利于干细胞、(前体)成骨细胞的分化[12-16]。目前,已开展了许多工艺例如喷砂、酸蚀、阳极氧化、等离子喷涂等,均旨在提高种植体与骨组织的结合能力,其效能在临床中已得到证实[6,17-19]。有文献表明,低氧诱导因子家族(hypoxia inducible factors,HIFs)是在缺氧环境下诱导干细胞动员的关键因子,致使细胞在恶劣条件下得以生存[20,21]。常氧环境下,脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases,PHD)羟基化HIFs,并使其迅速降解;脯氨酸径化酶抑制剂(proline hydroxylase inhibitors,PHI)例如二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG)能够抑制PHD的活性,从而抑制HIFs的降解,达到模拟低氧环境的目的;研究显示通过上调HIFs的表达,能够促进干细胞的分化,利于骨结合的形成,这在临床中引人思考[22,23]。从微观结构上看,骨矿化区主要位于细胞外基质,细胞外基质矿化质量的优劣将对骨质的理化性能和生物学性能产生重要影响,缺氧状态下所致的分化标志物水平的改变会对矿化物质的形貌和构成产生重要影响。然而,目前对成骨细胞系在缺氧状态下分化的研究基本限于细胞通路,而对于所形成的矿化物质的微观变化研究甚少。因此,基于以上研究背景,本研究主要围绕以下几个方面展开:(1)初步探索化学性低氧条件(DMOG)对于前体成骨细胞生理活动的影响,摸索出生物学适宜浓度,为后续研究提供基础。(2)通过酸蚀、电化学等对种植表面进行改性,引入化学性低氧条件,探索在该条件下,前体成骨细胞在改性后的材料表面的生物学效应。(3)进一步探讨前体成骨细胞在模拟缺氧环境中的形貌、矿化物质代谢行为的改变。第一部分不同浓度DMOG对前体成骨细胞MC3T3-E1生物学效应的初步探索目的:研究不同浓度DMOG对培养小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1的影响,筛选出生物相容性良好的药物浓度,为后续研究提供基础。材料和方法:将小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1置于含DMOG浓度梯度为0到100μM的DMEM/F-12(D/F-12)中培养,分别于1天、3天、5天后进行WST-1细胞增殖实验,检测MC3T3-E1生长趋势;台盼蓝排斥实验研究不同浓度DMOG的细胞毒性;同时利用ALP半定量活性检测不同浓度下细胞成骨方向分化的潜能。结果:WST-1细胞增殖结果显示,微量浓度(100-50μM)的DMOG能够支持MC3T3-E1在培养液中正常生长,虽然对细胞的增殖起到一定的抑制作用,但无明显细胞学毒性(死亡率2.81%--3.52%,与单纯D/F-12组之间无统计学差异);然而,随着培养液中DMOG的浓度升高(1000μM),MC3T3-E1的死亡率提升至32.50%,生长很大程度受到破坏,增殖的受抑制程度显著提升。更加有意义的是,500 μM浓度DMOG的培养环境能够明显上调MC3T3-E1细胞内的ALP活性,与不含DMOG的D/F-12培养条件下相比具有统计学差异,可作为后续实验展开的浓度基础。结论:1、微量浓度范围(100-500μM)的DMOG对MC3T3-E1细胞的生物相容性良好,能够支持MC3T3-E1的正常增殖。2、500μM微量浓度DMOG能够促进MC3T3-E1内相关成ALP活性的上调,具有成骨方向分化的趋势。第二部分DMOG对前体成骨细胞MC3T3-E1在不同材料表面生物学行为的影响目的:探索500μM DMOG模拟缺氧条件下MC3T3-E1在不同改性钛表面的细胞增殖、ALP活性与钙磷盐的沉积。材料和方法:采用电化学蚀刻技术与电化学沉积法相结合,制备粗糙钛(R-Ti)及沉积羟基磷灰石钛表面(HA-Ti),通过SEM与XRD表征样品。在常规以及模拟缺氧条件下(500μM DMOG)探索MC3T3-E1在S-Ti、R-Ti、HA-Ti表面的生物学特性,主要通过以下技术途径实施:WST-1增殖实验检测细胞的生存情况;ALP活性实验检测材料表面细胞的ALP活性;AR染色技术探索细胞成骨方向钙磷盐的沉积情况。结果:粗糙钛(R-Ti)及沉积羟基磷灰石钛表面(HA-Ti)在电镜下显示出疏松多孔微米结构,同时HA-Ti表面成功检测出HA特征峰。WST-1检测增殖结果与电镜结果显示,在改性后材料表面培养的细胞呈现出随着时间递增的增殖趋势;表面改性以及模拟缺氧条件下培养细胞的生长趋势受到了一定程度的抑制,但细胞可能进行成骨分化;ALP以及AR结果证实了在模拟缺氧条件下,细胞在改性后的表面ALP活性也得到了不同程度的上调、细胞外钙磷盐的分泌增加,成骨活性增强。结论:本研究中通过表面形貌以及化学成分对纯钛表面进行改性,所得到的材料生物相容性良好。MC3T3-E1在改性后的材料表面具有成骨方向分化增强的趋势,并且在模拟缺氧状态下,该作用得到增强,可能利于种植体在体内骨结合的潜能。第三部分模拟缺氧环境中各组材料表面MC3T3-E1的矿化行为研究目的:观察MC3T3-E1在模拟缺氧环境中的形貌、矿化物质代谢行为和矿化物质的微结构改变。材料和方法:将MC3T3-E1在分别接种于细胞爬片、S-Ti板、R-Ti板和HA表面,采用空白培养基、DMOG培养基、成骨诱导剂培养基和DMOG与成骨诱导剂联合培养基对各表面细胞分别培养1天和6天,运用FE-SEM对各样本细胞形貌进行观察,TEM观察细胞内矿化物质的形貌及分布情况,SAED对相应的矿化物质结构进行分析,EDX采集对应矿化物质的元素组成。结果:经DMOG刺激的细胞出现明显的微绒毛、囊泡、伪足等结构改变,并生成少量形态各异的结节状颗粒,成骨诱导剂具有促进作用,细胞内产生具有特定朝向的长条形晶体,晶体有明显的钙磷元素反应,但钙磷比均较正常HA晶体低。而仅受到成骨诱导剂作用的细胞内的矿物质多为无定型态,并最终形成体积大且形态不规则的钙盐结节。细胞在HA表面的矿化行为改变较其在细胞爬片、S-Ti板和R-Ti板表面的行为改变更为显著。结论:一定浓度和时间范围内,DMOG具有促进细胞矿化代谢的作用,能够形成与骨组织内矿物盐类似结构的晶体。HA是前体成骨细胞进行矿化的优良界面。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R783.1

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