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《武汉大学》 2017年
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微流控液滴操控与进样技术研究及其生物分析应用

陈金阳  
【摘要】:作为一种新兴的分析技术,液滴微流控在生物传感应用中具备很多优势:液滴体积微小、试剂和样品消耗少、实验成本低;液滴内部混合效率高、生化反应速率快、分析时间短;液滴尺寸均一、平行实验条件一致、适于高通量分析;液滴体系封闭、反应条件稳定。但液滴微流控在生物分析应用中同样也面临诸多挑战,如仪器设备昂贵、操作复杂、分析效率低、以及进样繁琐、样品切换慢等;另一方面,要实现液滴微流控生物分析,还需构建与液滴微流控相适应的生物传感策略。一种合适的传感策略,既要发挥液滴的优势,避免增加芯片设计及液滴操控难度,同时也要满足生物检测的高灵敏和高选择性要求。基于上述分析,为了建立简单、高效、低成本的液滴生物分析方法,本论文的研究工作主要围绕以下几个方面展开:1)提出了一种微流控液滴生成及融合的操控新技术。该技术主要是基于流水线式的模式进行液滴的操控,简称流水线式液滴操控。将该技术与基于氧化石墨烯的DNA生物传感策略相结合,实现了液滴微流控芯片中不同目标DNA的同时检测。该检测时间短、样品消耗量少。此外,该操控技术有利于提高实验效率和液滴分析通量,并且无需复杂的芯片设计和昂贵的仪器设备。2)利用PDMS通道壁的表面吸附与去吸附作用,建立了一种液滴给料新技术。日常实验中,双链DNA嵌入试剂SYBRGreenI易吸附污染PDMS通道,影响实验结果。我们巧妙利用这一现象,建立了一种接触式液滴给料技术。首先使SYBR Green I试剂充分吸附于给料区域的通道壁上,当含有双链DNA溶液的液滴流经该区域时,控制液滴与通道壁的接触程度,使SYBRGreenI试剂离开通道壁表面而进入液滴内。由于SYBR Green I试剂与双链DNA相互作用发射荧光,因此完成给料后的液滴显示明显的荧光信号。以该液滴给料技术为基础,分别结合T-Hg-T碱基对结构、DNA杂交和小分子连接的DNA末端保护技术,成功实现了重金属离子、DNA以及蛋白质的荧光检测。3)发展了一种简单、灵活、低成本的微流控样品引入技术。先将样品溶液储存在配备有自制PDMS适配接头的储液池中,在正压驱动下,样品溶液快速地从储液池中转移至芯片通道内。该样品引入技术兼容性好,能与不同结构的芯片结合进行液滴的生成与操控。并且,该技术还能简单快捷地进行不同样品的切换进样,为液滴微流控芯片多元快速检测奠定了基础。在液滴微流控芯片中,利用该样品引入技术,初步实现了浓度梯度生成、量子点荧光编码、以及液滴高通量筛选。此外,将该进样技术与前面提出的接触式液滴给料技术结合,成功进行了多元DNA检测。4)为了发展与液滴微流控分析系统相适应的生物传感策略,我们采用DNA模板法制备了一种新型的纳米铜/SYBR Green I复合试剂,并成功应用于H202及相关生物分子的灵敏检测。在该复合试剂中,小分子SYBR Green I吸附于铜纳米颗粒的表面,而不与双链DNA作用。但当复合试剂与H202溶液混合后,H2O2会破坏铜纳米颗粒的结构,从而使SYBR Green I离开铜纳米颗粒表面,而与溶液中的双链DNA作用,产生明显的荧光变化。利用这一现象,以H202检测为桥梁,实现了多种H202相关生物分子的检测。利用葡萄糖氧化酶和胆固醇氧化酶分别与对应底物的相互作用,实现了葡萄糖和胆固醇的检测。利用辣根过氧化物酶催化分解H202的特性,该方法还能用于辣根过氧化物酶的检测,表明该方法在荧光免疫分析中具有较好的应用前景。5)在上述纳米生物传感器构建的基础上,利用DNA自组装设计了一种哑铃型分子,该哑铃型DNA可以作为一种多功能模板,分别选择性地合成荧光银纳米团簇或铜纳米颗粒。该DNA模板设计简洁、金属纳米材料合成条件温和,结合DNA工具酶,我们建立了一种简单、非标记的ATP检测新方法,检出限为81 pM。实验结果表明,该方法具有较好的实用性和通用性;通过改进信号输出方式,将DNA自组装的哑铃型分子与双链DNA嵌入试剂SYBR Green I结合,建立了一种更灵敏、更稳定的ATP检测方法,改进后方法的检出限为4.8 pM;将改进后的方法与前面提出的接触式液滴给料技术和正压驱动储液进样技术相结合,成功实现了基于液滴微流控的ATP灵敏检测。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TB383.1

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