收藏本站
《武汉大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

核苷类药物多氧霉素和喷司他丁生物合成机制的研究

巫攀  
【摘要】:多氧霉素(Polyoxin,POL)是典型的二肽基核苷类抗生素,由于其卓越的抗真菌能力和环境友好而广泛应用于防治蔬果农作物的真菌感染。从化学结构上来看,多氧霉素由核苷骨架(尿苷类似物)和两个后修饰氨基酸组成,因其与真菌细胞壁的几丁质合成单元UDP-N-乙酰葡萄糖胺的结构相似故而为几丁质合成酶的强烈竞争性抑制剂。前期研究中已经克隆到多氧霉素生物合成基因簇,根据研究结果和生物信息学分析,对多氧霉素的生物合成途径做了初步推测,然而核苷骨架独特的化学结构使得其生物合成机制变得扑朔迷离,引起了很多研究者的浓厚兴趣。本研究工作之一旨在前期研究工作基础上,从分子水平上阐明多氧霉素核苷骨架生物合成机制,为发现和创造高活性的多氧霉素类似物提供理论基础。通过PCR-targeting手段,在含有多氧霉素生物合成基因簇的cosmid pJTU4774上对核苷骨架合成相关的基因polD,polH,poll,polJ和polK同框敲除,以多氧霉素生物合成基因簇大片段缺失菌株CXR14作为宿主菌构建相关突变株。对突变株发酵液进行检测分析后,确定了polD,polH和polK缺失的三个突变株有中间体累积。利用HPLC半制备分离纯化中间体,结合LC-MS和NMR检测结果解析出中间体化学结构,为进一步阐明核苷骨架生物合成机制和后续各基因编码的蛋白功能研究奠定坚实的基础。Po1H是Radical SAM超家族蛋白,这类蛋白通常具有催化新颖酶促反应的功能,由此推测PolH在多氧霉素核苷骨架的生物合成途径中扮演者非常重要的角色,研究其酶学功能具有重大意义。以polH突变株中累积的中间体作为PolH的底物测定酶活,然而并未获得预期结果。通过各种尝试和分析推测,确定3'-EUMP是PolH的催化底物,可将3'-EUMP转化成octosylacid。这一结果不仅对前期推测的多氧霉素核苷骨架生物合成途径进行了修正,也丰富了 Radical SAM这一类酶的功能。喷司他丁是抗生链霉菌NRRL 3238产生的含有独特的1,3-二杂氮七元环结构的嘌呤核苷类抗生素。喷司他丁作为强烈的腺苷脱氨酶抑制剂,目前是应用于临床上治疗白血病的一线药物。抗生链霉菌NRRL 3238中产生的另一个嘌呤核苷类抗生素—阿糖腺苷,与腺苷在化学结构上的区别在于2'位羟基的构型不同,作为腺苷类似物在临床上应用于抗DNA病毒的治疗。对喷司他丁的生物合成研究近三十年来,其生物合成基因簇一直未见报道,在本实验室前期研究中,成功地克隆到喷司他丁生物合成基因簇,并且发现在该基因簇同时负责阿糖腺苷的生物合成,且二者生物合成之间相互独立。本研究的另一部分工作是基于分子遗传学和体外生化、酶学等,证实了“一个基因簇负责两种药物生物合成且二者生物合成途径相互独立”的独特生物合成机理,以及喷司他丁作为腺苷脱氨酶抑制剂保护阿糖腺苷产生的保护与被保护机制。利用PCR-targeting的方法,在含有喷司他丁生物合成基因簇的cosmid pWHU1106上对每一个基因进行逐个敲除。以多氧霉素生物合成基因簇大片段缺失菌株CXR14作为宿主菌构建相关突变株。对突变株发酵液进行检测分析,确定了penA,penB和penC三个基因与喷司他丁生物合成相关,penD-penJ七个基因与阿糖腺苷生物合成相关。根据生物信息学分析,在抗生链霉菌NRRL 3238基因组上鉴定四个腺苷脱氨酶SanADA1-4。在大肠杆菌表达系统中将这四个腺苷脱氨酶超量表达并在体外纯化,分别以腺苷和阿糖腺苷作为底物对其测酶活。体外生化实验证明,只有腺苷脱氨酶SanADA3对腺昔和阿糖腺苷都有明显活性,且喷司他丁对催化阿糖腺苷的抑制作用更强。此外,对SanADA3催化腺苷和阿糖腺苷的反应测定了相关动力学参数Km、kcat和Ki值,也与体外生化实验结果一致。PenB是短链脱氢还原酶(SDR)超家族蛋白,负责催化喷司他丁生物合成的最后一步,催化6-酮基喷司他丁还原生成喷司他丁。体外生化实验证实,PenB对6-酮基喷司他丁和喷司他丁都有催化作用,说明喷司他丁生物合成最后一步是一个可逆的氧化还原反应。本研究在前期研究基础上,分别对核苷类药物多氧霉素的核苷骨架生物合成和喷司他丁生物合成的机制从体内和体外进行了研究。多氧霉素核苷骨架的生物合成通过体内敲除实验获得了两个中间产物并对其进行了结构解析,通过体外生化实验鉴定了 Radical SAM蛋白PolH的功能;喷司他丁的生物合成通过体内敲除实验和体外生化实验揭示了“一个基因簇中包含两种药物(喷司他丁和阿糖腺苷)生物合成基因且二者相互独立”的生物学现象以及保护与被保护的生物合成机制,通过体外生化实验也鉴定了喷司他丁生物合成最后一步是由短链脱氢还原酶PenB催化的可逆反应。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ927;TQ455.5

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 何瑛;用基因工程新技术抑制树木中木素的生物合成[J];西南造纸;2004年03期
2 吴杰群;刘文;张嗣良;;红霉素的生物合成与组合生物合成[J];有机化学;2012年07期
3 王述安;发酵过程中糖的维持浓度与土霉素生物合成的关系[J];抗生素;1981年01期
4 J·SHVINKA;U.VIEST;M·RUKLISHA;邱志成;;黄色短杆菌赖氨酸生物合成的产量调节[J];发酵科技通讯;1981年02期
5 谢幸珠,徐京宁,奚建云,周月宝;磷酸盐对洁霉素产生菌的生长及生物合成洁霉素的影响[J];抗生素;1983年02期
6 戴伟国;种子培养条件对头孢菌素生物合成的影响[J];国外药学(抗生素分册);1983年04期
7 Malcolm R.Siegel;林荫年;潘大钧;;抑制甾醇的杀真菌剂——对甾醇生物合成的影响和作用部位[J];农药译丛;1983年01期
8 贺贤国;;~(13)C核磁共振谱与生物合成研究[J];化学通报;1985年11期
9 三川潮;陈寿松;;稳定同位素在生物合成研究中的应用现状[J];原子能农业译丛;1985年03期
10 戴伟国;;在实验装置中研究振动搅拌对抗生素生物合成的影响[J];国外药学(抗生素分册);1986年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 姚戈;曹瑛;应天翼;陈冀胜;;蓝藻毒素生物合成研究进展[A];中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集[C];2011年
2 阎家麒;鲁习金;;埃博霉素的生物合成[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年
3 储炬;胡景;谌颉;庄英萍;张嗣良;;异亮氨酸促进阿维菌素生物合成的机理研究[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
4 周东坡;平文祥;迟彦;朱婧;赵凯;马玺;;树状多节孢生物合成紫杉醇相关基因的筛选[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
5 洪高洁;于宗霞;陈晓亚;;红光促进青蒿素生物合成和植物萜类次生代谢的机理研究[A];第三届全国植物蛋白质组学大会摘要集[C];2010年
6 谭华荣;;微生物次级代谢产物生物合成的分子调控[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
7 唐功利;彭超;蒲津越;宋立强;唐满成;蹇晓红;;四氢异喹啉生物碱生物合成中新途径的发现[A];中国化学会第28届学术年会第3分会场摘要集[C];2012年
8 金以豐;劉法椿;;纈氨酸生物合成的控制 一、多黏桿菌乙酰乳酸合成酶系的形成和性質[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
9 贺竹梅;;黄曲霉毒素生物合成调控机制的研究[A];第十一届中国生物毒素研究及医药应用年会论文摘要集[C];2013年
10 刘钢;潘园园;何希宏;谭华荣;;圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成调控基因作用的分子机制[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前8条
1 记者 胡其峰;组合生物合成研究获重大突破[N];光明日报;2014年
2 李生;组合生物合成促进大环内酯类新药开发[N];中国医药报;2006年
3 钱铮;日本新发现加速抗生素生物合成机制[N];医药经济报;2006年
4 潘以楼 杨敬辉 宋立妹;菌毒清和多氧霉素[N];江苏农业科技报;2008年
5 安徽省黄山市人民医院儿科主任医师 方元勋;治疗流感不宜用阿糖腺苷[N];健康报;2013年
6 ;多氧霉素(polyoxin)[N];农民日报;2001年
7 秦鉴;中药的“双向调节”作用(下)[N];上海中医药报;2004年
8 ;稀有天然药物生物合成与合成生物学研究[N];中国医药报;2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 巫攀;核苷类药物多氧霉素和喷司他丁生物合成机制的研究[D];武汉大学;2017年
2 杨勇;厦门链霉菌318中厦门霉素生物合成机制的研究[D];上海交通大学;2014年
3 严威;球毛壳菌生物碱的生物合成研究[D];南京大学;2014年
4 宁小敏;Wnt3a在EMSC脂肪细胞线粒体生物合成和蛋白乙酰化中的作用研究[D];西北农林科技大学;2016年
5 马艳玲;阿扎霉素F_(3a)生物合成相关基因的克隆和功能分析[D];武汉大学;2014年
6 郭远洋;氧化偶氮霉素的生物合成机制研究[D];浙江大学;2016年
7 朱夜琳;大肠杆菌中吲哚丙酮酸的代谢工程研究[D];中国科学技术大学;2017年
8 陈超;FK506(他克莫司)生物合成新菌株的构建[D];大连理工大学;2015年
9 方伟;真菌糖脂与多糖的生物合成研究[D];南京大学;2013年
10 刘静;亮氨酸应答调控因子Lrp调控抗生素生物合成的分子机制及应用[D];安徽大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙婉;DNA assembler技术在顺,顺—己二烯二酸和Siderophere生物合成中的应用[D];北京协和医学院;2015年
2 张汉宁;FR901464中四氢吡喃环的生物合成机制研究[D];上海应用技术学院;2015年
3 肖灵晨;大肠杆菌异源生物合成硫代葡萄糖苷[D];北京化工大学;2015年
4 常俊俊;酶催化生物合成L-酪氨酸研究[D];南京大学;2014年
5 袁鹏;aldoTL参与的dalesindole生物合成研究[D];南京大学;2015年
6 罗秀秀;岗梅三萜皂苷生物合成相关CYPs基因的挖掘与功能研究[D];广州中医药大学;2015年
7 任鹏飞;海洋芽孢杆菌B-9987中Macrolactins生物合成相关基因功能研究[D];中国海洋大学;2015年
8 李永毅;谢氏丙酸菌维生素B_(12)生物合成核糖开关敲除的功能研究[D];河北科技大学;2013年
9 陈作毅;石杉碱生物合成与代谢调控途径的研究[D];福建农林大学;2013年
10 史国印;Cuevaenes的生物合成研究与结构改造及ansatrienins后修饰研究[D];山东大学;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026