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《武汉大学》 2017年
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长链非编码RNA(IncRNA) HOTAIR上调NOX2促进缺氧诱导的脑梗死形成

杨雷  
【摘要】:背景及目的:越来越多的研究表明长链非编码RNA HOTAIR在肿瘤的发生发展过程中起到了至关重要的作用,但很少有研究报告其对中枢神经系统疾病的影响,而针对缺血性脑梗死的研究则未见报道。脑梗死的病理生理机制当中,氧化应激对脑组织带来的损伤尤为关键,它可以导致脑内活性氧(ROS)生成增加,进一步加重脑组织缺血缺氧,导致细胞凋亡、死亡,出现神经功能缺损。体内有多种酶可以产生ROS,其中NADPH氧化酶2(NOX2)倍受关注,当局灶性脑缺血发生时,NOX2的表达升高,导致ROS生成增多,使脑组织出现不可逆性损伤。本课题试图通过研究HOTAIR在缺氧状态下对NOX2蛋白表达水平的影响,进一步揭示HOTAIR在脑梗死形成过程中可能存在的功能意义及影响。方法:1.建立缺氧诱导的小鼠大脑中动脉缺血MCAO模型,并将小鼠海马神经元HT22细胞体外缺氧处理,分别应用RT-PCR法及Western Blot法检测不同缺血、缺氧时间段脑孤立梗死灶及HT22细胞内HOTAIR和NOX2蛋白表达水平。2.分别转染pcDNA-HOTAIR、si-HOTAIR至HT22细胞,检测NOX2蛋白表达水平,并观察对HT22细胞凋亡的影响。3.通过RNA pull-down和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)技术,进一步研究HOTAIR和NOX2蛋白之间可能存在的关联。结果:1.通过RT-PCR法成功检测到小鼠脑内孤立梗死灶及HT22细胞HOTAIR mRNA表达上调,并呈现明显的时间依赖性。2.通过Western blot法成功检测到小鼠内脑孤立梗死灶及HT22细胞NOX2蛋白表达上调,并呈现明显的时间依赖性。3.随着缺氧时间的延长,HT22细胞TUNEL染色凋亡阳性细胞的百分率明显增高。4.在HT22细胞内,转染了 pcDNA-HOTAIR的TUNEL染色凋亡阳性细胞百分率较对照组显著增高,同时检测到NOX2蛋白产物明显增多。5.HOTAIR基因静默导致HT22细胞NOX2蛋白产物明显降低,同时TUNEL染色凋亡阳性细胞的百分率明显降低。6.RNA pull-down实验证实,HOTAIR与NOX2蛋白之间可以高度特异性结合,HOTAIR可以绑定NOX2蛋白使其表达增高。7.RNA免疫沉淀实验证实,与NOX2蛋白特异性结合的RNA即为HOTAIR,HOTAIR和NOX2之间存在特定关联。结论:HOTAIR通过调节NOX2表达促进缺氧诱导的缺血性脑梗死发生,可增加我们对缺血性脑梗死的分子机制的认识。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R743.3

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